生长发育期镧暴露影响钙信号与血脑屏障细胞旁通透性的研究

Rare earth element lanthanum influences the central neurodevelopment of children, short- or long-time lanthanum exposure affect learning and memory ability of developmental rats, and cause neurobehavior changes. Crossing blood-brain barrier is the premise of lanthanum neurotoxicity, however, there is no report about the influence of lanthanum on blood-brain barrier permeability. Regulation of paracellular permeability are mainly through alteration on junction complex and cytoskeleton rearrangement, in which brain endothelial calcium homeostasis plays a pivotal role, involving phosphorylation of protein kinases, increase of matrix metalloproteinases activity, and activation of myosin light-chain kinase and Rho kinase. Previous study demonstrated that lanthanum induced calcium overload within nerve cells, but relevant influence in brain endothelial cells is still unknown. Therefore, in this research, we use lanthanum chloride exposure through drink water to establish animal model, and use bEnd.3 cells as in vitro blood-brain barrier model, to reveal the influence of lanthanum on blood-brain barrier paracellular permeability, involving alteration on junction proteins expression and actin cytoskeleton rearrangement, and to uncover the mediation of correlated signaling pathway, with the purpose of providing experimental reference data for fully illustrating the mechanisms of neurodevelopment toxicity of lanthanum.

稀土元素镧影响儿童中枢神经系统发育，短期或长期镧暴露影响发育期大鼠学习记忆能力，并引起神经行为改变。跨越血脑屏障是镧在脑部蓄积并发挥神经毒性作用的前提，但镧对血脑屏障通透性的影响目前未见报道。细胞旁通透性的调控主要通过连接复合体的改变和细胞骨架重排，脑内皮细胞钙稳态在其中发挥关键作用，分子机制涉及蛋白激酶的磷酸化，金属基质蛋白酶活性增高，肌球蛋白轻链激酶和Rho激酶的激活。既往研究证明镧可引起神经细胞内钙超载，但其对脑内皮细胞内钙浓度及连接蛋白和细胞骨架相关分子的影响尚不清楚。因此，本研究拟采用饮水氯化镧暴露仔鼠染毒模型和 bEnd.3细胞体外血脑屏障模型，揭示镧对血脑屏障细胞旁通透性的影响，连接蛋白表达改变和肌动蛋白细胞骨架重排的参与，以及相关信号通路的介导作用，为全面阐明镧的神经发育毒性作用机制提供实验参考数据。

稀土元素镧具有神经毒性，可造成稀土矿区儿童和实验动物的认知障碍，主要表现为智商和学习与记忆能力下降。血脑屏障完整性对于保护脑组织防御外源性毒物损害和维持中枢神经系统内环境稳态从而保证神经元功能正常运行具有重要作用。血脑屏障功能障碍是多种重金属神经毒性的重要靶点，但镧对血脑屏障的影响尚不清楚。本研究通过对出生至断乳后一个月大鼠进行氯化镧饮水暴露建立动物模型，利用形态学、生物化学与分子生物学、免疫荧光组织化学等实验技术，探讨镧对生长发育期大鼠血脑屏障通透性的影响，与连接蛋白改变和细胞骨架重排的关联，以及基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）和细胞骨架调控信号通路在其中的作用，并通过脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞非接触共培养构建体外血脑屏障模型，进一步揭示肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）和RhoA/ROCK通路在细胞骨架重排和连接蛋白稳定性改变中的介导作用，为全面阐明镧的神经发育毒性作用机制提供实验证据。结果显示氯化镧暴露使仔鼠大脑半球伊文氏蓝渗出量显著增多，毛细血管超微结构发生改变，脑内皮细胞连接复合体紧密连接蛋白claudin-5，occludin和粘附连接蛋白VE-cadherin表达降低，且高剂量组claudin-5和VE-cadherin mRNA转录水平显著下降，致使血脑屏障通透性增高；MMP-2/-9活性和MMP-9蛋白及mRNA表达水平显著增高，其内源性抑制因子TIMP-1蛋白和mRNA水平均降低，但MMP-2和TIMP-2蛋白与mRNA水平均无明显改变；提取的脑毛细血管和bEnd.3细胞实验结果均表明，MLCK和RhoA/ROCK2通路激活，下游效应分子MYPT1和肌球蛋白MLC2的磷酸化水平均显著增高，致使细胞骨架重排，F-actin聚合形成应力纤维；MLCK或ROCK抑制和细胞内钙螯合可通过逆转应力纤维形成和促进粘附连接相互作用，从而改善镧所致的通透性增高。综上我们得出，镧可致血脑屏障损害，调控细胞旁通透性的紧密和粘附连接组分occludin、claudin-5和VE-cadherin蛋白表达下调，机制可能与脑MMP-9的活化参与连接蛋白水解，内皮细胞钙超载致使ROCK和MLCK信号激活促进细胞骨架重排，加剧紧密连接损伤有关。