微管正端跟踪蛋白EB1动态巴豆酰化调控细胞有丝分裂的机制解析

As a key member of cytoskeletons, microtubules participate in multiple cellular events such as morphology formation and maintenance, chromosome movement, transport of protein, RNA and vesicles. A series of proteins called “plus-end tracking proteins (+TIPs)”, such as EB1, localize at the plus-ends of microtubules, regulate microtubule dynamics and mitotic fidelity. Our previous study has revealed a pivotal role of EB1 dynamic acetylation at K220 in accurate chromosome alignment and segregation. During our extensive study on post-translational modification of +TIPs, we identified an EB1 crotonylation stie, K66, on its highly conserved N-terminal CH domain. In our study, crotonylation of EB1 regulated spindle orientation and positioning and equal chromosome segregation during mitosis. Under support of major research plan, we aim to delineate the molecular mechanism of EB1 dynamic crotonylation and using our newly developed small molecule, USTC60, we will uncover molecular mechanism underlying spindle plasticity and cell fate decision regulated by EB1 dynamic modification network.

微管作为重要的细胞骨架，调控细胞形态的建立与维持、染色体运动与胞内物质运输等。在微管的正末端，有一系列微管正端跟踪蛋白如EB1，它们调控微管的动态性及细胞有丝分裂的质量。我们的早期研究揭示了EB1第220位赖氨酸的动态乙酰化是染色体排列与精准分离的重要调控机制，我们最新探索发现EB1负责与微管结合区域的第66位赖氨酸在有丝分裂期被p300巴豆酰化。我们的预实验提示，EB1巴豆酰化调控纺锤体在有丝分裂期的精准定向与染色体均等分配。我们拟在“生物大分子动态修饰与化学干预”重大研究计划引导下，阐明EB1动态修饰的分子特征与效应机制，并利用选择性干预EB1巴豆酰化识别的化学小分子探针USTC60，解析EB1动态修饰网络调控纺锤体可塑性与细胞命运抉择的分子机制。

包含在染色体中的父代遗传信息通过纺锤体丝与染色体着丝粒的协同作用来完成有丝分裂。有丝分裂调控异常促进肿瘤的发生与发展。有丝分裂纺锤体定向主要依赖于皮层相关复合物与微管上结合的动力蛋白复合物之间建立连接，但至今人们对微管结合蛋白如何调控纺锤体定向的具体机制还知之甚少。在系统探索微管正端跟踪蛋白EB1的翻译后修饰的过程中，我们发现了第66位赖氨酸是TIP60在体外和体内巴豆酰化EB1的主要位点，细胞动力学表型分析提示EB1巴豆酰化调控了有丝分裂纺锤体可塑性与染色体稳定性。为了解析EB1巴豆酰化的生理功能，我们利用非天然氨基酸嵌入技术，在哺乳动物细胞内表达巴豆酰化的EB1，发现EB1持续巴豆酰化导致有丝分裂期星体微管动态性与可塑性的剧烈变化。进一步的机制研究发现巴豆酰化调控纺锤体基质蛋白NuMA与EB1的动态结合。超高分辨活细胞显微成像发现，EB1通过与NuMA形成复合物衔接星体微管与细胞皮层从而调控纺锤体定向，而这一功能受到动态巴豆酰化修饰的严密调控。鉴于二维细胞培养不能模拟细胞命运抉择的细胞间的生物力传感、细胞应答极化的微环境变化及生理病理学动态演进过程，我们建立了TIP60突变基因敲入小鼠，并成功获得了可视化三维胃类器官，利用片层光显微成像系统评估了TIP60-EB1巴豆酰化的生理学功能，解析了巴豆酰化修饰动态性精密调控纺锤体定向的生理学功能（Song et al., 2021. Nat Chem Biol）。在已有的研究基础上，我们还系统地解析了EB1的物理化学性质在有丝分裂中的功能。通过检测EB1及其相互作用蛋白SKAP的相分离，发现它们具备相分离的特性，并且SKAP相分离液滴可以募集Aurora B激酶形成共相分离液滴。值得一提的是，SKAP的相分离形成区室保证了Aurora B激酶的活性，确保了有丝分裂染色体的正常队列与分离（Zhang et al., 2021. J Mol Cell Biol）。这些研究为详尽阐述染色体不稳定性以及癌症发生的分子机制提供新的视角。