微管正端示踪蛋白EB3对PEDV复制的调控作用及其分子机制

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection can cause 100% mortality in newborn piglets. The global outbreak of porcine epidemic diarrhea has brought serious harm on the pig industry and sounded the alarm for the prevention PEDV. Virus and host cell interaction underlies antiviral research. The interaction of virus encoded proteins with microtubule-associated proteins influences viral replication process through regulating the dynamic and homeostasis of microtubule network, this phenomenon has attracted much attention in the field of virology. Previous studies have indicated that PEDV M protein interacts with plus-end tracking protein EB3. Thus, in order to further clarify the role of EB3 in PEDV replication process, co-immunoprecipitation, 3D Live Cell Imaging, gene silencing and overexpression and other methods are used to analyze whether the interaction between PEDV M and EB3 proteins induces the transport of PEDV encoded proteins and the assembly and release of virions in this project. Meanwhile, we also analyze the influence of PEDV M protein and EB3 protein interaction on microtubule homeostasis and virus replication while further to explore the underlying molecular mechanisms. In conclusion, this project will provide new theoretical basis for deeply understanding the replication mechanisms of coronavirus and design of antiviral drugs.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）的感染可致幼龄仔猪100%死亡，其全球爆发给养猪业带来了严重危害，也给PEDV的防控敲响了警钟。病毒与宿主细胞互作机制是抗病毒研究的理论基础。病毒编码蛋白与微管相关蛋白互作，通过调节微管的动态及稳态进而影响病毒复制过程，此现象在病毒学研究领域备受关注。前期研究证明PEDV M蛋白与微管正端示踪蛋白EB3存在相互作用。为了进一步明确EB3蛋白在PEDV复制过程中的作用，本研究拟通过免疫共沉淀、3D活细胞激光共聚焦分析成像技术、基因沉默与过表达等方法，深入分析PEDV M和EB3蛋白相互作用是否介导PEDV编码蛋白的运输及病毒粒子的装配释放，同时分析PEDV M蛋白和EB3蛋白相互作用对微管稳态和病毒复制的影响，并探寻其分子机制。本研究将为深层次解读冠状病毒复制机制及为抗病毒药物设计提供新的理论基础。

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的，该病是猪的一种急性、高度接触传染性的肠道疾病，以严重的肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征，发病率有时高达100%，死亡率为30~80%。因此，开展PEDV复制机制相关的基础研究具有重要性，在解析冠状病毒的复制机制方面更有普遍的借鉴意义。.病毒严格胞内寄生，在感染早期，病毒粒子需要从细胞边缘移动到细胞核附近进而完成复制。作为细胞的通道，微管是平行排列的αβ微管蛋白二聚体构成的管状结构，两端具有极性，在非极性细胞中，微管正极指向细胞膜，负极指向微管组织中心。病毒从细胞边缘到细胞核的运动是向微管负极的运输，称为反向运输，病毒从细胞核周到细胞边缘的运动是向微管正极的运输，称为正向运输。病毒沿微管的运输常常需要微管相关蛋白的参与，并且病毒蛋白与微管相关蛋白的相互作用被认为是病毒运输的关键。.为了进一步探寻M蛋白与宿主之间相互作用网络，本试验以PEDV M蛋白全长为诱饵，利用酵母双杂交技术，筛选Vero E6和IPEC细胞cDNA 混合文库，鉴定出与M蛋白相互作用的新的宿主因子EB3蛋白。经酵母回转验证EB3蛋白在酵母系统中与全长M蛋白存在相互作用。免疫共沉淀试验进一步证实发现PEDV M蛋白和微管正端示踪蛋白EB3在哺乳细胞中存在相互作用，激光共聚焦试验发现PEDV M蛋白和EB3蛋白共定位与细胞质中。在研究EB3蛋白对病毒复制的作用中发现，在PEDV感染的细胞中EB3蛋白的表达显著上调。同时发现过表达EB3蛋白时，可促进M蛋白的表达和PEDV的增殖；相反，利用靶向EB3蛋白的特异性干扰小RNA分子沉默PEDV易感细胞内源性EB3蛋白的表达，M蛋白的表达和PEDV的增殖均受到抑制。进一步研究发现PEDV的感染可以促进磷酸化GSK3β和乙酰化微管蛋白的表达，使微管处于稳定状态。.本文首次描述了微管正端示踪蛋白EB3与PEDV M蛋白存在相互作用并正调节病毒的复制，同时阐明了PEDV感染促进微管的稳定。通过研究PEDV M蛋白与微管相关蛋白的互作关系，对PEDV乃至冠状病毒的运输分子机制具有重要的借鉴意义。