银耳二型态相关基因的克隆与鉴定

银耳（Tremella fuciformis），是一种二型态（dimorphism）的胶质食用真菌。银耳不仅和其他山珍海味一样是人们餐桌上的珍品，同时也是中医药学中一种久负盛名的良药，具有较高的食用、药用及经济价值。以银耳酵母相（yeast phase）和菌丝相（mycelium phase）为材料，应用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术分别构建正相和反相两个差减cDNA文库，并结合高密度点阵膜（array）及点杂交（dot blot）技术克隆在银耳酵母相和菌丝相中差异表达的基因，揭示银耳二型态现象与基因表达变化的内在联系，同时应用RNA干涉（RNAi）技术研究差异表达基因的功能，鉴定银耳二型态相关的功能基因，进一步探讨银耳二型态的分子机理，为丰富真菌二型态的基础理论、加快银耳的分子育种进程、提高银耳的产量与质量奠定基础。

银耳（Tremella fuciformis）是一种重要的二型态胶质食用真菌。本研究构建了以银耳芽孢相为检测对象的正向抑制性差减差减文库和以菌丝相为检测对象的反向抑制性差减差减文库。经菌落PCR检测，两个差减文库的有效重组率分别达到80%和87%，插入的cDNA片段大小在250-1000bp之间。通过PCR筛选和Dot blot杂交，从正、反两个文库中选取300个差异表达克隆进行测序，经Blast比对与GO分析，结果显示正、反向文库中分别有54.24%和62.68%的基因获得功能注释，这些基因涉及催化、调节、结合、运输、信号转导、调控翻译、分子伴侣等方面。RT-PCR验证了细胞壁生化合成相关蛋白、锌指UFM1肽酶结合域蛋白、MAP激酶、琥珀酰辅酶A：3酮酸辅酶A转移酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2B、G蛋白α-亚基等基因在酵母相与菌丝相明显差异表达。利用SEFA-PCR和RACE技术，克隆了银耳α-微管蛋白和G蛋白α-亚基全长基因。以银耳α-微管蛋白基因启动子为驱动元件，潮霉素B磷酸转移酶和绿色荧光基因为双报告基因，Ti质粒pCAMBIA1300构建了双元载体pTTEH，建立了根癌农杆菌介导的银耳转化体系。以银耳α-微管蛋白基因启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子为驱动元件，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸转移酶基因为目的基因，构建了干涉载体pTGPi，利用重组PCR将潮霉素磷酸转移酶、5’同源臂和3’同源臂成功融合成敲除盒，以pCAMBIA1300为基础骨架构建了G蛋白α-亚基基因的敲除载体PGA，通过转化和转化子与出发菌株表达量分析及菌落形态对比，分别研究这两个基因的初步功能。