反式作用小分子干扰RNA基因TAS3a的功能调控元件分析及优化

反式作用小分子干扰RNA（trans-acting siRNAs，tasiRNAs）是一类内源的、特化的小分子干扰RNA（siRNA），在拟南芥中产生于TAS1～4共4个TAS基因家族。其中只有TAS3在其他植物中具有保守性。然而，有关TAS3基因（包括人为超表达的TAS3基因）在植物体内产生ta-siRNAs的关键调控因素和限制性因子尚不清楚。可能的关键调控因素包括：miR390的表达水平；Ago7的表达水平；对应于负链的"顺式作用"siRNAs；两个miR390靶位点之间的距离等。本项目将针对上述候选的关键因素进行分析，阐明影响TAS3a产生ta-siRNAs的瓶颈性因素并提出解决方案，在此基础上获得更优化表达人工ta-siRNAs的改进型TAS3a。研究结果对于深入理解小分子干扰RNA的生物合成与作用机制具有重要的参考价值，对于使用人工tasiRNAs进行基因抑制具有重要的指导作用。

反式作用小分子干扰RNA（trans-acting siRNAs，ta-siRNAs）是一类内源的、特化的小分子干扰RNA（siRNA），在拟南芥中产生于TAS1～4共4个TAS基因家族。其中只有TAS3在其他植物中具有保守性。然而，有关TAS3基因（包括人为超表达的TAS3基因）在植物体内产生ta-siRNAs的关键调控因素和限制性因子尚不清楚。我们对拟南芥TAS3基因产生ta-siRNAs的限制性因子进行了分析。XVE诱导表达分析（包括诱导表达miR390a的time-course分析）表明，miR390表达水平是体内TAS3a产生ta-siRNA的限制性因子；AGO7、SGS3和DRB4等不是限制性因子。我们将miR390a基因插入TAS3a的内含子中，得到的TAS3a-miR390融合基因有更好的干扰效果，且AGO7、SGS3和DRB4等对TAS3a-miR390的增强效果不明显。将两个miR390靶点之间的序列进行截短，发现截短的TAS3a干扰效果好于全长型，且两个miRNA390位点间的最短间距为2个ta-siRNA长度单位。将miR390-miR173融合基因插入TAS3a-TAS1c融合基因的内含子中，得到的四基因融合基因，其转录本被miR173切割后产生的5′和3′断裂片段可同时按照TAS3a和TAS1c的机制产生功能性ta-siRNAs。总之，miR390是TAS3a产生ta-siRNAs的瓶颈性因素；两个miRNA390位点间的最短间距为2个ta-siRNA长度单位；截短型的TAS3a-miR390以及TAS3a-TAS1c-miR390-miR173融合基因可以作为更加高效抑制靶基因的工具。