基于代谢组学技术的脾虚大鼠脾失健运机理研究

The results of the early study show that under the condition of spleen insufficiency, peroxidation damage to the body is worsened, which leads to structural changes of cell membrane and affects function of the membrane protein.Then it influnces the information transmission acrossing cell membranes, giving rise to structural change of the mitochondrial, mtDNA missing mutations, shortening of nDNA telomere as well as expression differences of part of the protein,etc.In order to explore the essence of the spleen theory, animal models of spleen-qi deficiency,spleen-yang deficiency and spleen-yin deficiency are established in this study.Then the essence of spleen-deficiency-syndrome is explored with the method of metabolomics from different level of tissues, cells and moleculars respectively. The different small molecules metabolites related to dysfunction of spleen in transporting and transforming are selected with the method of metabolomic analysis on the tissue of liver, kidney tisue and the ileum of the model rats with spleen-deficiency-syndrome,so as to explain the changes of pathways and situation of material metabolism due to spleen dificiency.It will be mutually identificated with fruits of proteomics research in early research to establish the related index system of syndrome of spleen failing in transporting and transforming. From point of systematical biology, the connotation of spleen's function in governing transformation and transportation will be interpreted, and then, modern molecular biology basis of spleen theory will be expounded.

本课题组前期研究结果表明，脾虚状态下，机体过氧化损伤增强，使细胞膜结构发生变化，影响了膜蛋白的功能，进而影响到跨膜信息的传递，使线粒体结构改变，mtDNA缺失突变，nDNA端粒缩短，部分蛋白质差异表达等。为继续深入探索脾藏象理论的本质，本次研究从脾主运化功能入手，采用快速液相色谱-离子阱飞行时间质谱( UFLC-IT-TOF-MS) 获取大鼠血浆、尿液代谢轮廓，并用主成分分析法(PCA) 进行多变量统计分析，探索新的"病症结合"脾虚模型造模方法，分别找出用于区分经中药治疗干预后大鼠同正常对照大鼠、脾虚证大鼠的重要差异代谢物，筛选出脾虚证不同证型间的相关差异小分子代谢物群，建立脾虚证机体内物质代谢途径及状况的代谢图谱。结合前期研究，与蛋白质组学的研究成果相互认证，从系统生物学角度全面诠释脾主运化功能的内涵，阐明脾藏象理论的现代分子生物学基础。

本课题组前期蛋白组研究筛选及鉴定出的差异性表达蛋白涉及物质代谢、组织构成、细胞信号转导、细胞死亡、增殖等多个方面，但其中绝大部分与糖、脂类、蛋白质代谢过程密切相关。提示脾虚证证候本质很有可能就是由于糖原含量的改变、糖的分解代谢降低、生物膜脂质过氧化增加、蛋白质翻译后修饰降低四个方面协同作用，从而导致机体整个代谢功能紊乱。. 在此基础上，本次研究成功建立并评价了大鼠脾气虚、脾阳虚和脾阴虚动物模型，从脾主运化功能入手，基于GC-TOF-MS的代谢组学脾虚三证模型大鼠回肠组织、血清的生物学特征，结合剖检、光镜观察脾虚证大鼠胃和回肠病理学改变，ELISA法测定MDA、GSH-Px、钠钾ATP酶、钙镁ATP酶、线粒体呼吸酶链复合物Ⅰ、Ⅳ的表达差异,共同探讨脾虚化源不足的相关指标体系，涉及细胞损伤、物质能量代谢、细胞信号转导等多个方面，从系统生物学角度诠释脾虚及脾主运化的内涵，揭示脾虚证脾失健运的物质基础和发生机制。并且对脾虚证经典方药从“神经-体液-免疫”及细胞通路角度进行疗效机制探讨，实验结果提示处于脾虚状态下的机体会在胃肠动力、神经调节、能量代谢及免疫等方面均会出现异常且不同证候间差异不存在一定规律，且经典中药均可以有效改善脾虚症状、恢复胃肠动力、调节能量代谢、干预免疫应答，提示这可能是经典方药现代生物学疗效之一，同时cAMP-PHK-PKA通路可能是脾虚证经典方药的干预靶点之一。代谢组学经生物学分析共鉴定出百余种与脾虚证发生相关的代谢产物并分析出相关代谢通路12条，其中脾气虚证、脾阳虚证、脾阴虚证状态下代谢产物均与苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成存在不同程度上的相关性，提示本代谢通路可能是三证的共同基础。. 本研究成果已在国内核心期刊上发表论文7篇，在辽宁科学技术出版社出版著作1部，衍生国家级、省级课题3项，培养在读硕士研究生4人，留学生2人，完成硕士研究生毕业论文1篇。为后续脾虚证的更加进一步研究提供有力依据。