文心兰体细胞无性系叶绿素缺失突变的分子机制研究

Breeding of new cultivars with colorful leaf is an important goal in the germplasm innovation of orchids. Chlorophyll-deficient mutation exists in the micropropagation of orchids universally. In the present study, we hope to understand the molecular characteristics of somaclonal variation in the chlorophyll-deficient mutants and the normal somaclones of Oncidium (Orchidaceae). The frequency of mutations in DNA- and cDNA-AFLP loci will be comparatively detected. The different fragments in cDNA-AFLP loci will be sequenced, and will subsequently be analyzed with Blast tools. Meanwhile, in order to investigate the molecular mechanism of chlorophyll-deficient mutations in somaclones of Oncidium, the candidate genes of chlorophyll-deficient will be isolated by differential expression analysis of cDNA-AFLP loci between mutants with colorful leaf and normal plants with green leaf. Then, the changes on sequence, coding product and protein structure of candidate genes in mutants will be analyzed. Followed that, the expression of candidate genes will be detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Altogether, we expect to understand the molecular characteristics of somaclonal variation and the molecular mechanism of chlorophyll-deficient mutations in somaclones of Oncidium, and therefore accumulate theoretical basis for the breeding of orchids by somaclonal variation, especially for the breeding of cultivars with colorful leaf.

色叶艺新品种培育是兰花种质创新的重要目标。体细胞无性系叶绿素缺失突变在兰花的离体快繁中普遍存在。本项目拟（1）以来自同一原球茎诱导的1-16世代的文心兰体细胞无性系叶绿素缺失突变体和叶色正常株为材料，以未经组织培养的亲本为对照，通过分析DNA-和cDNA-AFLP位点的变异，并对cDNA-AFLP变异位点进行序列测定、同源性比对和功能分析，以探明文心兰体细胞无性系的分子变异的特征及规律；（2）通过叶绿素缺失突变体和叶色正常株的cDNA-AFLP差异表达分析分离叶色性状相关基因，分析突变体中叶色性状相关基因序列的变化，及由此引起的编码产物、蛋白结构的差异，并通过荧光定量PCR了解基因的表达模式，从而揭示文心兰体细胞无性系叶绿素缺失突变的分子机制。本研究旨在加深对兰花体细胞无性系的分子变异和叶色突变的分子机制的了解，为基于体细胞无性系变异的兰花新种质创造，特别是色叶艺新品种培育积累理论基础。

色叶艺新品种培育是兰花种质创新的重要目标。体细胞无性系叶绿素缺失突变在兰花的离体快繁中普遍存在，可成为兰花色叶艺新种质创造的一条重要途径。对兰花体细胞无性系的分子变异规律的掌握及其叶绿素缺失突变分子机制的了解是更好地创造变异、筛选变异和利用变异的前提。本项目以前期积累的文心兰体细胞无性系黄化突变体和浅绿条纹突变体为材料，对其突变形成的生理和分子基础展开研究，旨在为基于体细胞无性系变异的兰花新种质创造，特别是色叶艺新品种培育积累理论基础。主要研究及结果如下：.（1）叶绿素合成受阻和叶绿体发育异常导致叶绿素含量减少，从而使突变体叶片呈现黄色或浅绿条纹，光能利用率降低。.（2）采用CE-AFLP技术对10份浅绿条纹突变体进行分析表明，突变体在DNA水平均发生了不同程度的变异，变异率在12.3~19.9%之间。以12份体细胞无性系及其亲本为材料，采用SLAF-seq技术开发出157,521个SLAF标签，每个无性系平均检出241,474个SNP和10,220个InDel。cDNA-AFLP分析结果表明，体细胞无性系叶色突变体和正常株均发生了不同程度的cDNA-AFLP位点变异，前者的第一和第二世代分别累积了0.19~0.44%和0.44~0.69%的变异，后者的第一和第二世代分别累积了0.31%和0.56%的变异，世代越高，累积的变异越多。差异片段中，与代谢、基因表达调节及信号转导相关的所占比例较大，分别为13.79%、8.05%和6.90%。.（3）利用Illumina HiSeqTM 4000测序平台对文心兰正常植株和浅绿条纹突变体进行转录组测序，共得到46,058条Unigene，31,059条获得功能注释（占67.4%）。其中，2,252条Unigene在突变体和正常植株间差异表达，963个上调，1,289个下调。进一步分析筛选出与叶绿素代谢、叶绿体发育和光合系统相关的差异表达基因共19个。RT-qPCR分析表明18个差异表达基因的表达趋势与转录组数据相符。其中镁螯合酶亚基H（CHLH）基因下调表达，叶绿素b还原酶（NOL）基因上调表达可能是导致突变体叶绿素含量减少的关键因素。捕光叶绿素a/b结合蛋白（LHCB7）基因和铁氧还蛋白基因表达下调，多个编码核糖体蛋白大、小亚基的基因表达量显著改变可能是导致叶绿体结构发育缺陷的直接原因。