基于蛋白质组学技术的脾虚大鼠脾失健运机理研究

本课题组前期研究结果表明，脾虚状态下，机体过氧化损伤增强，使细胞膜结构发生变化，影响了膜蛋白的功能，进而影响到跨膜信息的传递，使线粒体结构改变，mtDNA缺失突变，nDNA端粒缩短等。为全面探索脾藏象理论的本质奠定了一定的基础。本次研究首先建立大鼠脾气虚、脾阳虚和脾阴虚动物模型，从脾主运化功能入手，运用蛋白质组学和形态学等方法，从器官、组织、细胞和分子等不同层次探讨脾虚证脾失健运的本质。用剖检、光镜、扫描电镜观察脾虚证大鼠胰、胃、小肠病理学改变；用酶法测定血清淀粉酶、放射免疫方法测定血清胃泌素及血浆胃动素水平；用比色法测定胃黏膜组织碳酸酐酶、琥珀酸脱氢酶、三磷酸腺苷酶活性；同时，对脾虚证大鼠肝、肠、胰腺组织进行蛋白质组学分析，筛选出与脾失健运相关的蛋白质组，探讨脾虚化源不足的相关指标体系，从系统生物学角度诠释脾虚及脾主运化的内涵，揭示脾功能的物质基础，阐明脾藏象理论的现代分子生物学基础。

本次研究首先建立大鼠脾气虚、脾阳虚和脾阴虚动物模型，从脾主运化功能入手，通过对脾虚证大鼠回肠组织蛋白质组学筛选分析,结合剖检、光镜观察脾虚证大鼠胃和小肠病理学改变，酶法测定血清淀粉酶、放射免疫方法测定血清胃泌素及血浆胃动素水平，比色法测定回肠组织琥珀酸脱氢酶、三磷酸腺苷酶活性，免疫组化法检测水通道蛋白4的表达差异,共同探讨脾虚化源不足的相关指标体系，从系统生物学角度诠释脾虚及脾主运化的内涵，揭示脾虚证脾失健运的物质基础和发生机制。研究结果发现脾虚证模型组大鼠胃泌素含量明显升高，淀粉酶、琥珀酸脱氢酶、钠钾ATP酶、胃蛋白酶的活力及胃动素含量均明显降低，经中药治疗后上述指标明显好转；蛋白质组学经质谱和生物信息学分析，共鉴定出21种与脾虚证发生相关的蛋白质，其中7种蛋白表达上调，15种蛋白表达下调。脾气虚模型组有上调的胰蛋白酶、葡萄糖调节蛋白78以及下调的白蛋白；脾阳虚模型组有上调的蛋白二硫键异构酶A3、埃兹蛋白、假定未知蛋白、磷酸化应激诱导蛋白、丙酮酸激酶、结蛋白、角蛋白8和下调的角蛋白1和19、GAPDH、肌动蛋白；脾阴虚模型组有上调的钙联蛋白、乌头酸水合酶、Papss2、过氧化氢酶和乙醇脱氢酶，下调的肌动蛋白、热休克蛋白90。这些蛋白涉及物质代谢、组织构成、细胞信号转导、细胞凋亡和增殖等多个方面，其中绝大多数与物质和能量代谢过程密切相关。研究结果表明脾失健运的发生与细胞内Ca2+超载有关，脾气虚与细胞内质网的应激和血液循行速度减慢关系更为密切；脾阳虚与糖代谢异常关系紧密；脾阴虚与脂类过氧化损伤的关系更加密切。这可能是脾虚证脾失健运的病理机制之一。