牛奶中多类型β-内酰胺酶通用免疫学构效关系及分析应用研究

随着我国乳制品抗生素残留限量的不断降低，β-内酰胺酶常被违法添加以有效水解抗生素，从而导致消费者食用后耐药性增高，抵抗力下降。β-内酰胺酶种类繁多，目前的检测方法或为针对单一种类酶分子的"一对一"检测，或为间接检测抗生素底物或水解产物的定性方法。本课题拟对可直接检测多种β-内酰胺酶的"一对多"定量免疫检测方法进行研究。通过改进抗体制备技术，获得可识别牛奶中多种β-内酰胺酶的广谱特异性抗体；选择适当的分析模式及标记技术，建立免疫检测试剂盒；并研究β-内酰胺酶在添加入牛奶后的活性代谢过程，为监管部门从不同环节监测、控制奶品质量提供重要的技术依据。同时，以此体系为平台进行多目标抗原广谱特异性抗体的制备方法、抗原氨基酸序列相似性与抗体亲和力的半定量关系、以及蛋白质二级或三级结构免疫原性的研究，深入探索免疫学规律，为预测抗体性质，间接制备不稳定或不易获得的蛋白的抗体提供参考依据。

本研究针对我国乳及乳制品中违法添加β-内酰胺酶以水解超标抗生素的现象，开展了相关研究。以免疫分析和生物传感器为手段，通过改进抗体制备技术、优化抗体标记及固定化模式，成功建立了快速、灵敏、低成本、高通量的β-内酰胺酶半定量免疫检测试剂盒，以及国际先进的酶热生物传感器定量检测技术（定量限达4 U/mL）。获得了能够识别多组分β-内酰胺酶的广谱特异性抗体，并初步探索了抗原氨基酸序列相似性与免疫原性之间的关系。在此基础上，利用所建立的分析技术研究了β-内酰胺酶在乳品加工及存放过程中的变化轨迹，低温长时间和高温短时间巴氏杀菌过程均不会对牛奶中β-内酰胺酶活性产生显著影响，而经过超高温灭菌后，β-内酰胺酶活性消失，为监测产品和时机的选择提供了依据。同时，对全国部分地区的乳品进行了β-内酰胺酶本底调查，总检出率仅为3.8%，为内外源性β-内酰胺酶的界定及违法添加的判定提供了依据。