环状RNAciRS-7调控miR-7信号通路参与针刺促脑缺血小鼠血管新生的作用机制研究

Angiogenesis is an important way to reduce the brain damage by improving the local blood supply to the brain after cerebral ischemia, and non-coding RNAs have an important regulating role in angiogenesis and a competitive inhibition relation. In the preliminary study of our research group, miR-7 was found to be a pathological factor of the occurrence and development of cerebral ischemia and an important therapeutic target for promoting cerebral angiogenesis. Recent researches on circRNAs suggest that circRNAs ciRS-7 may regulate miR-7 and affect the expression of its target genes as a miRNA sponge. According to the above stated, this project will use MCAO mouse model to examine multidimensional angiogenesis related ciRS-7, miRNA-7 and its target genes with western blot, qRT-PCR, exogenous inhibition and over-expression method in order to discuss the function of ciRS-7 regulating miR-7 signaling pathway in the mechanism of acupuncture promoting cerebral ischemia, and finally explain the possible material basis and effective target of acupuncture reducing cerebral ischemia injury by promoting cerebral angiogenesis from circRNA-miRNA-mRNA of non-coding RNA level to provide objective experimental and theoretical basis for acupuncture treating cerebral ischemia.

血管新生是脑缺血后改善大脑局部血液供应从而减轻脑损伤的重要途径，非编码RNAs在机体血管新生中具有重要的调控作用并存在竞争性抑制。课题组前期RNA芯片检测发现miR-7是脑缺血发生发展的病理环节和针刺促脑血管新生的重要治疗靶点。新近热点circRNAs的研究显示，环状RNA ciRS-7作为miRNA海绵能够调控miR-7进而影响其靶基因的表达。有鉴于此，本项目拟在前期工作基础上，采用MCAO小鼠模型，运用qRT-PCR、western blot、外源性抑制和过表达等技术，多环节多维度观察针刺对脑缺血小鼠脑ciRS-7、miR-7及其血管新生相关靶基因的影响，探讨ciRS-7调控miR-7信号通路参与针刺促脑缺血后血管新生的作用机制，从非编码RNA之circRNA-miRNA-mRNA层面阐释针刺促脑血管新生的可能物质基础与有效作用靶点，为针刺治疗脑缺血提供客观的实验与理论依据。

脑缺血是由于脑部血液供应障碍导致局部缺血缺氧性坏死而迅速出现相应神经功能缺损的临床综合征，具有致死率和致残率高的特点。血管新生是脑缺血后改善大脑局部血液供应从而减轻脑损伤的重要途径。课题组前期RNA芯片筛查发现miR-7是脑缺血发生发展的病理环节和针刺促脑血管新生的重要治疗靶点。新近circRNA研究显示，ciRS-7作为miRNA海绵能够调控miR-7进而影响靶基因的表达。因此，本项目在前期工作基础上，采用MCAO小鼠模型，运用神经功能缺损体征评分、TTC染色、HE染色评估针刺对MCAO小鼠的治疗作用；运用免疫组化等技术观察针刺对MCAO小鼠脑微血管密度和VEGF的影响；运用qRT-PCR、western blot、外源性抑制和过表达等技术，研究针刺对脑缺血小鼠脑ciRS-7、miR-7及其血管新生相关靶基因的作用机制。研究结果显示，针刺治疗后MCAO小鼠的神经功能缺损体征评分降低，脑梗死体积下降，脑组织水肿及神经元坏死程度减轻，脑微血管密度增加，缺血侧大脑皮质VEGFmRNA和蛋白表达水平上调。提示针刺对MCAO小鼠有治疗作用，能够减少脑梗死体积，改善神经缺损症状，这种治疗作用可能与其促血管新生有关。分子机制研究显示，针刺治疗可显著提高MCAO小鼠大脑皮质ciRs-7的表达，同时显著降低miR-7的表达，进而上调靶基因KLF4、IGF-1和ANG-2mRNA和蛋白的表达水平。进一步机制研究显示，敲低miR-7后，由于miR-7对靶基因的抑制作用被减弱，MCAO小鼠VEGF、IGF-1、ANG-2、KLF4mRNA和蛋白的表达较模型组显著升高；过表达miR-7后，针刺对上述靶基因的上调作用明显被减弱。敲低ciRs-7后，MCAO小鼠VEGF、IGF-1、ANG-2、KLF4mRNA和蛋白进一步减低，而针刺对于上述靶基因的上调作用明显被减弱。提示，ciRS-7调控miR-7信号通路参与了针刺促脑缺血小鼠脑血管新生的过程，针刺可通过调节ciRS-7解除miR-7对于靶基因的抑制作用，促进血管新生。本项目从ceRNA的角度探讨针刺调控ciRS-7/miR-7信号通路促脑缺血后血管新生的效应机制，在非编码RNA层面拓展了针刺促脑缺血后血管新生效应机制研究的广度和深度，为针刺治疗脑缺血提供了客观的实验依据。