大鼠新基因LM23选择性剪接异构体在精子发生中的功能和作用机制研究

LM23(AF492385)是我室发现的大鼠睾丸组织特异表达基因。在前一项国家自然科学基金研究中，发现了LM23通过促进细胞周期进程来调控精子发生的功能，并从大鼠睾丸组织中克隆出一个新的LM23基因选择性剪接异构体-svLM23。前期研究工作表明svLM23在大鼠睾丸组织表达显著高于其他组织，且能明显促进细胞增殖，因此推测该剪接异构体在精子发生和成熟过程中可能发挥重要调节作用。本研究拟建立svLM23条件型knockout小鼠模型，从整体、细胞和分子水平来研究svLM23在个体发育/精子发生中的作用及其机制。应用分子生殖学实验手段分析svLM23缺失突变小鼠的生殖功能、睾丸形态和细胞学变化；利用Co-IP、酵母双杂交等技术鉴定svLM23相互作用蛋白，揭示svLM23参与生精细胞调控的分子机制和信号转导途径。该基因功能、机制的研究和条件型knockout小鼠模型建立均具有原创性。

LM23(GenBank: AF492385)是本研究小组发现的大鼠睾丸组织特异表达基因。本研究组前期研究发现，LM23通过促进细胞周期进程调控精子发生,并从大鼠睾丸组织中克隆出一个新的LM23基因选择性剪接异构体svLM23,其在大鼠的多种组织广泛表达，且能明显促进生精细胞增殖。.为了进一步研究LM23 （Spdya）在精子发生中的功能及其分子调控机制，本课题利用 Gateway技术构建Spdya表达载体，通过DNA显微注射的方式获得LM23 （Spdya）过表达转基因的小鼠系；通过表型和生育分析发现过表达转基因小鼠产仔率显著高，雄雌鼠仔的性别比高（2:1)，推测该基因可能影响性别分化。本课题已经建立条件型LM23（Spdya）基因敲除小鼠模型，发现杂合子鼠（LM23+/-）能生育，纯合子鼠（LM23-/-）尚在幼崽阶段，有待在整体、细胞和分子水平上，进一步研究LM23（Spdya）对于小鼠发育和精子生成的作用和机制。.本课题还对调控LM23（Spdya）基因表达的miRNA进行了筛选和鉴定，发现miRNA-23b调节LM23的表达影响生精细胞的增殖和凋亡。另外,本研究发现过表达svLM23对293T细胞细胞有促进增殖，抑制凋亡的作用。双荧光素酶报告基因系统检测发现svLM23对NF-κB通路有激活作用，对wnt通路有轻微的抑制作用。本课题还利用RT-PCR 和 real-time PCR方法，检测了LM23和svLM23在大鼠出生后不同时期的表达量,结果显示LM23随着出生天数的增加表达量逐渐增高，在出生后30天的大鼠睾丸中表达量达到最高，之后表达量又下降。而svLM23的表达量则无明显的变化。.最后，本研究采用高通量小RNA 测序系统研究了miRNA 在小鼠B 型精原细胞(BSc)和初级精母细胞(PSc)中的表达谱. 结果显示,在这2种细胞类型中let-7 miRNA 家族的表达水平都相当高。并且在BSc 向PSc 的转化过程中, miR-21, miR-140-3p,miR-103, miR-30a, miR-101b 和miR-99b 的表达水平明显降低。结果提示，这些miRNA 参与调控与细胞凋亡、细胞增殖和分化、连接组装和细胞周期调控相关的诸多基因的表达.