新基因RSA-14-44在精子发生中的功能研究

精子发生是男性生殖生物学的一个重大课题，是生命周期中的一个重要环节，也是一个特殊的细胞分化过程。在这一过程中发生了许多其它体细胞分化过程中所没有的特殊现象，最典型的是精子发生早期的减数分裂以及后期的变态成形。本课题采用现代细胞生物学和分子生物学技术,进行RSA-14-44在精子发生过程中对细胞分裂和细胞骨架变化方面影响的研究,旨在揭示精子发生过程中RSA-14-44对细胞分裂及伴随的细胞骨架变化的调节作用,对阐明精子发生过程中遗传分子对生精细胞分裂及精子变形机制的影响有重要的意义，为治疗男性不育和开发新的避孕药提供新思路。

精子发生是男性生殖生物学的一个重大课题，是生命周期中的一个重要环节，也是一个特殊的细胞分裂分化过程。阐明精子发生过程中遗传分子对生精细胞分裂及精子变形机制的影响有重要的意义，为治疗男性不育和开发新的避孕药提供新思路。本课题利用现代分子生物学技术中基因克隆、蛋白原核表达、多克隆抗体制备、免疫组织化学法、免疫荧光技术、Pulldown和免疫共沉淀技术研究了一个睾丸特异性基因RSA-1444及与其相互作用的蛋白PMSB5在精子发生过程中的功能。研究结果发现，在精子发生过程中RSA-1444和PSMB5定位于细胞浆中，免疫荧光表明两种蛋白在胞浆中共定位。利用免疫组织化学法定位了两种蛋白在精子发生过程中不同时期的表达，证明两个蛋白都能够在睾丸组织细胞中共表达，主要分布在粗线期精母细胞、圆形精子和长形精子的胞浆中。利用pull-down实验和免疫共沉淀法研究了两种蛋白的在体内体外都存在相互作用。利用免疫荧光的方法进一步证明，在粗线期初级精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞及成熟精子等精子发生过程中RSA-14-44与PSMBS存在共定位。这表明两个蛋白在精子发生过程中可能发挥着关键作用。由于PMSB5是20S蛋白酶体的主要组成成分，我们研究了两个基因蛋白酶体26S和20S的酶活性是影响，表明发现RSA14-44和PSMB5对酶活性均有一定的促进作用，但在二者协同作用时使20S和26S蛋白酶体的显著提高，尤其对蛋白酶体20S活性提高更加显著。由于文献已经报道蛋白酶体可促进肿瘤细胞分裂，我们利用RSA-1444基因过表达稳定细胞系研究了该基因对细胞分裂的影响，结果发现RSA-1444对细胞分裂没有显著的影响。同时利用纺垂体标记蛋白γ-tubulin和细胞骨架标记蛋白actin标记染色，表明RSA-14蛋白在CHO的表达定位随细胞分裂各个时期发生变化。我们推测可能RSA-1444是睾丸特异性基因，在模式细胞中不能显示出对细胞分裂功能的影响。因此，由以上实验结果可以推断RSA-14-44基因可能通过与蛋白酶体20S的亚基PMSB5相互作用调节蛋白酶体的活性来发挥在精子发生过程的功能。