肾素-血管紧张素系统和RhoA/ROCK交互作用在糖尿病肾病肾小球炎症中的作用

研究表明，早期糖尿病肾病（DN）肾小球中就存在单核/巨噬细胞浸润，这与DN进展和肾小球硬化密切相关。代谢紊乱导致肾小球内皮细胞（GEnC）粘附蛋白表达的增多和细胞连接破坏为炎症细胞浸润提供了条件。我们前期研究发现肾素-血管紧张素系统（RAS）的激活可以破坏GEnC细胞连接和上调粘附蛋白的表达。而RhoA/ROCK信号通路在调节细胞连接中起重要作用。因此我们假设，RAS和RhoA/ROCK 信号通路交互作用能介导GEnC细胞连接的破坏和上调粘附蛋白的表达，从而促进炎症细胞浸润肾小球。本项目拟采用siRNA和ROCK1-/-小鼠等方法，旨在评价和证实肾小球内皮细胞RAS和RhoA/ROCK信号通路交互作用在介导单核/巨噬细胞粘附和穿过内皮细胞单层中的作用。本项目有望揭示糖尿病肾病炎症细胞浸润的新机制，为确立RAS抑制剂和RhoA抑制剂联合应用治疗DN提供更充分的科学依据。

有研究表明，早期糖尿病肾病肾小球中就存在着单核巨噬细胞的浸润。这与糖尿病肾病的进展和肾小球硬化密切相关。其中，晚期糖基化终产物（AGEs）对单核细胞在糖尿病肾病肾小球系膜区的沉积起着重要作用。Ras蛋白超家族RhoA和RhoA/ROCK通路在调节细胞迁移方面起着重要作用。我们假设AGEs通过RhoA/ROCK通路影响内皮细胞的粘附改变和炎症。实验方法： ROCK抑制剂Y27832(10 mmol/l)预刺激大鼠肾小球内皮细胞半小时，加入80μg/ml的AGEs与大鼠肾小球内皮细胞共培养24小时。将ROCK1-siRNA转染进大鼠肾小球内皮细胞， ICAM-1、PECAM-1和MCP-1在内皮细胞中的表达。从大鼠腹腔提取巨噬细胞，用以巨噬细胞细胞对内皮细胞的迁移实验。采用db/db小鼠作为糖尿病的模型，分为六个组，分别为1、db/m，n=6；2、db/m+法舒地尔 （10mg/kg/day），n=6；3、db/m+生理盐水，n=6；4、db/db，n=6；5、db/db+法舒地尔（10mg/kg/day），n=6；6、db/db+生理盐水，n=6。第8周开始实验。20周的时候处死小鼠，并取出肾脏组织，分离皮质，做HE染色、PAS染色、电镜和免疫组化染色，提取蛋白做western blotting。结果：AGEs能引起大鼠肾小球内皮细胞表达ICAM-1、PECAM-1和MCP-1表达水平上调，而加入ROCK阻滞剂Y27632后，AGEs刺激内皮细胞表达ICAM-1、PECAM-1和MCP-1的上调受到抑制。AGEs促使巨噬细胞向内皮细胞迁移，阻滞RhoA/ROCK通路后，巨噬细胞迁移受到抑制。法舒地尔能改善糖尿病肾病肾小球中粘附分子和炎症因子的表达，减少炎症和细胞浸润。结论：RhoA/ROCK通路在糖尿病肾病肾小球炎症中对炎症因子的释放和巨噬细胞浸润有重要影响，抑制这条通路能减轻糖尿病肾病肾小球炎症。