PPAR-β激动剂对晚期糖基化终产物致肾小球内皮细胞紧密连接破坏的保护机制

在前期研究中，我们发现PPAR-β激动剂能逆转晚期糖基化终产物（AGEs）引起的肾小球内皮细胞（GEnC）紧密连接破坏。但具体机制尚未清楚。近年研究表明，RhoA/ROCK信号通路在调节细胞紧密连接中起重要作用。由此我们提出假设，PPAR-β激动剂能通过RhoA/ROCK信号通路逆转AGEs对GEnC紧密连接的破坏。本项目拟从以下方面开展研究：1.通过沉默和过表达PPAR-β基因进一步明确PPAR-β在AGEs破坏紧密连接中的作用；2.建立稳定转染Activated RhoA、Dominant negative RhoA和Wild type RhoA质粒的GEnC，探讨RhoA/ROCK通路在PPAR-β激动剂保护GEnC紧密连接中的作用。3.采用ROCK1-/-基因敲除小鼠，验证PPAR-β激动剂是否通过RhoA/ROCK-1通路保护GEnC紧密连接。为糖尿病肾病寻找新的治疗药物和靶点。

目的 肾小球内皮细胞之间的紧密连接破坏是导致肾小球滤过屏障通透性增高，以致蛋白漏出增多的重要机制之一。在前期研究中，我们发现过氧化物酶增殖体激活受体β（PPAR-β）激动剂能逆转晚期糖基化终产物（AGEs）引起的大鼠肾小球内皮细胞（rGEnCs）紧密连接破坏。本研究主要探讨PPAR-β激动剂逆转AGEs引起的rGEnCs紧密连接破坏的机制。方法 不同浓度AGEs分别作用rGEnCs不同时间，通过siRNA 沉默PPAR-β基因和ROCK-1基因，PI3K抑制剂LY294002、ROCK-1抑制剂Y27632和PPAR-β激动剂L165041预处理细胞后加入AGEs刺激细胞，测定跨内皮细胞电阻抗和FITC-BSA滤过率，免疫印迹法检测JAM-A、Occludin、ROCK1、PPAR-β的表达和Akt、MYPT1磷酸化，Pull-down assay检测RhoA活性的改变，免疫荧光检测紧密连接的完整性；ROCK1基因敲除和野生型小鼠用链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病肾病模型，检测ROCK1基因敲除对尿白蛋白排泄率和PPARβ、JAM-A和Occludin表达的影响。结果 AGEs可引起rGEnCs通透性、Akt和MYPT1磷酸化水平以及RhoA活性升高，紧密连接蛋白JAM-A、Occludin表达下降， PPAR-β激动剂预处理可减轻该作用；siRNA 沉默PPAR-β基因可促进AGEs对紧密连接的破坏，siRNA 沉默ROCK-1基因可减轻该作用，PI3K抑制剂、ROCK-1抑制剂与PPAR-β激动剂的使用可逆转AGEs对紧密连接的破坏；体内实验也证实，在糖尿病肾病中致病因素可通过RhoA/ROCK-1信号通路对肾小球紧密连接产生破坏并影响PPAR-β的表达。结论 PPAR-β激动剂可通过影响PI3K-Akt和RhoA/ROCK-1 信号通路减轻AGEs引起的肾小球内皮细胞紧密连接破坏，保护肾小球内皮细胞通透性。