棉铃虫寄生蜂病毒BEN基因功能的研究

Polydnavirus(PDV) is unique not only in that the virus exists in a provirus and obligate association but also in that virus replication is restricted to the ovarian calyx cells in the wasp host and is asymptomatic. Previous studies have showed that once PDVs infect a host, the vast majority of the expression products is present in the host blood cells, causing the host immune suppression and/or adjusting the host physiological state, to ensure the successful development of the parasitic wasp. This complex process remains a lot of unknowns. Recently a novel BEN domain protein gene family was found in related PDV genomes, and it may play an important role in the host and the parasitic wasp interaction. By using the cotton bollworm larvae and Microplitis mediator wasp as major materials, the objectives of this proposal are to: 1. Determine the BEN domain protein gene transcription level in different tissues in vivo by RT-qPCR; 2. Analyses the different domain's function in BEN gene by constructing trunction mutants from overlap extension PCR and site-directed mutagenesis method, transfecting insect cells and observing the cells under fluorescence microscope; 3. Demonstrate that BEN protein is SUMOylated by immunoblots and immunoprecipitation analysis; 4. Characterize interaction between the BEN domain protein and related proteins during the parasitization by using Pull-down assays and immune co-precipitation approaches. Our project addresses the mechanism for pest control by analyzing the polydnavirus specific gene function.

BEN基因是在茧蜂多分DNA病毒基因组中发现的新基因，在寄主和寄生蜂相互作用过程中可能通过抑制寄主细胞转录发挥重要作用。本项目以棉铃虫寄生蜂中红侧沟茧蜂所携带的茧蜂病毒为研究对象，通过RT-qPCR，确定在活体条件下BEN基因在寄主体内的转录水平和组织特异性；采用重叠延伸PCR和定点突变方法，构建含不同长度BEN基因的重组子，并转染离体昆虫细胞，结合荧光显微观察，确定BEN基因各主要基序的功能。通过构建含有BEN基因的表达载体，检测BEN蛋白在感染离体昆虫细胞中被SUMO修饰状况，证明BEN为转录抑制因子；通过Pull-down和免疫共沉淀技术，分别在活体或离体条件下分离与BEN蛋白相互作用的蛋白质，根据质谱分析结果，搜寻相关蛋白数据库，鉴定与BEN蛋白相互作用蛋白质。通过对BEN基因功能的研究，阐明BEN蛋白在寄主-寄生蜂相互作用过程中的作用及调节机制，从分子水平探讨害虫综合治理新途径。

1. 在中红侧沟茧蜂多分DNA病毒基因组中发现两个BEN结构域蛋白基因，分别命名为MmBEN0.4和MmBEN1.0。新发现的两个基因都具有单一的BEN结构域。比较二者BEN结构域，其氨基酸同源率为62.6%。其中MmBEN0.4结构域蛋白与毁侧沟茧蜂多分DNA病毒B片段蛋白MdB1氨基酸同源率达87%。.2. MmBV BEN结构域蛋白的结构特点。在MmBV基因组中发现的两个BEN结构域蛋白基因全长分别为331个氨基酸残基和127个氨基酸残基，预期分子量分别为37.7kD和14.4kDa。蛋白质二级结构分析表明，MmBEN0.4和MmBEN1.0分别含５个和3个α螺旋（α-helix）基序(motif)。α螺旋区域与特定的DNA序列相结合并调节转录。.3.转录分析表明MmBEN0.4在寄生昆虫幼虫体内转录，为一新基因。通过在不同时间点，从被中红侧沟茧蜂寄生的粘虫中提取总mRNA，并分别合成cDNA，并以其为模板，MmBEN0.4特异引物，检测MmBEN0.4在寄生昆虫幼虫体内的转录。结果显示：被寄生24h的三龄粘虫样品中，能检测到MmBEN0.4的转录，并且持续至第7天，但转录本呈递减趋势。另一方面，通过分别提取被寄生48h的三龄幼虫的不同组织mRNA，分别提取总cDNA，并以此这模板，MmBEN0.4特异引物，RT PCR结果显示，在整虫和血淋巴中检测到MmBEN0.4的转录，其它组织没有检测到MmBEN0.4转录。.4. 研究表明MmBEN0.4蛋白定位于细胞核内。根据BEN结构域蛋白在其它生物体内可能的功能，将MmBEN0.4克隆到pIZT-V5质粒，构建MmBEN0.4-V5融合表达载体，转染Hi5细胞，3天后利用V5抗体及荧光标记二抗完成细胞免疫荧光实验，在倒置荧光显微镜下观察，可以检测到MmBEN0.4蛋白存在于Hi5细胞核内。由此可推断MmBEN0.4在寄生昆虫幼虫中存在位置。此结果为MmBEN0.4作为新的转录抑制因子，与特定DNA结合提供证据。.5. 在中红侧沟茧蜂病毒基因组中发现了一个vank基因（Mmvank）。病毒的ank基因属ikB基因家族，为细胞核转录因子（NF-kB/Rel）的抑制因子。Mmvank基因的发现为进一步研究MmBV各转录抑制因子之间相互作用及对鳞翅目昆虫寄主的影响打下了基础。