宫颈癌中HSF1相互作用蛋白的筛选及功能研究

Recent researches have found that heat shock factor 1 (HSF1) increased in many cancer such as cervical cancer, influenced the growth, infiltration and metastasis of tumor cells and related to tumor prognosis and resistance to chemotherapy. However its mechanisms were not clear. It's reported that HSF1 could interact with many proteins and play effects in the course of inflammation, tumor and so on. This project hence make a hypothesis: HSF1 interacts with some special proteins in cervical cancer. And these proteins cooperate with HSF1 to influence the genesis and development of cervical cancer. In the project we decide to screen and identify proteins interacting with HSF1 by using high-through proteomical techniques such as immunoprecipitation and mass spectrography analysis firstly. Next detect the expression of these proteins in cervical cancer through real-time PCR and western blot. Then construct many expression plasmids including different gene fragments of HSF1 or its interacting proteins respectively to ascertain the key interacting domain. Finally observe their effects on HeLa cells by intervening the interaction between HSF1 and HSF1-interacting proteins through mutating the key interacting domain and explore their functions. The project is expected to widen and deepen the research of pathogenesis of cervical cancer and provide clues for the new intervention targets and treatments.

近年发现热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）在宫颈癌等许多肿瘤中高表达，影响肿瘤细胞的生长和浸润转移，与肿瘤预后及耐药相关，但其机制并不清楚。HSF1可与许多蛋白质发生相互作用，参与诸如炎症、肿瘤等的发生。本项目由此提出假说：宫颈癌中HSF1可与某些蛋白质发生相互作用，这些相互作用蛋白与HSF1一起影响了宫颈癌的发生发展。本项目拟采用高通量的蛋白质组学技术如免疫沉淀与质谱分析等技术筛选并鉴定宫颈癌组织中的HSF1相互作用蛋白；再通过real-time PCR、western-blot等对这些相互作用蛋白在宫颈癌中的表达进行检测；接着通过构建包含HSF1或其相互作用蛋白不同片段的表达质粒，确定二者的核心结合区域；最后通过对核心结合区域进行突变，干预二者的相互作用，观察其对宫颈癌细胞的影响，探讨其功能。本项目有望拓宽和深化宫颈癌发病机制的研究，为寻找新的宫颈癌干预靶

背景：宫颈癌是一种发病机制尚未阐明的最常见的妇科恶性肿瘤；热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一种在多种肿瘤中高表达的肿瘤调节因子，能影响肿瘤细胞的生长与浸润转移，与肿瘤预后及耐药相关，但是其机制并不清楚；HSF1能与许多蛋白因子发生相互作用，协同发挥调控功能；因此，研究宫颈癌中HSF1相互作用蛋白或许能揭示宫颈癌发生发展的分子机制。研究内容：本课题主要采用免疫沉淀与质谱分析相结合筛选鉴定宫颈癌中HSF1的相互作用蛋白，采用免疫共沉淀（co-IP）、酵母双杂交、激光共聚焦实验验证HSF1与CCAAT增强子结合蛋白β（CCAAT enhancer binding protein beta, C/EBPβ）之间的相互作用，同时通过构建不同缺失突变体，确定HSF1与C/EBPβ的相互作用重要结构域，最后采用CCK-8细胞活性检测法、划痕实验和transwell实验探讨HSF1与C/EBPβ的相互作用对细胞功能的影响。结果：（1）HSF1在宫颈癌组织中高表达，且与宫颈癌的浸润深度、分化程度和淋巴转移相关。（2）正常宫颈组织与宫颈癌组织中分别鉴定出220个和241个HSF1相互作用蛋白，其中仅69个为两种组织中共有，且差异的HSF1相互作用蛋白具有不同功能分类，宫颈癌中HSF1相互作用蛋白更多与选择性剪切、蛋白质修饰等相关。（3）HSF1与C/EBPβ在宫颈癌中具有相互作用；HSF1的311-529位氨基酸结构域可能是HSF1与C/EBPβ相互作用的关键结构域，HSF的137-310位氨基酸结构域与HSF1的转位入核相关，并非与C/EBPβ相互作用的关键结构域；C/EBPβ的氨基端和羧基端均能与HSF1相互作用。（4）HSF1与C/EBPβ相互作用可以抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖与迁移；HSF1与CEBPβ的相互作用也可以抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖与迁移；HSF1缺失137-310位氨基酸后无法转位入核，但是仍能发挥促进细胞增殖和迁移的作用。意义：HSF1可能通过与不同蛋白质相互作用促进宫颈癌的发生发展；HSF1与C/EBPβ的相互作用可能参与多种肿瘤细胞的发生发展；HSF1可能不仅仅只是作为一种转录因子入核发挥调控基因转录的作用，其在胞浆中也可能具有多样化的作用。