筛选盐藻MBP相互作用蛋白及功能研究

核基质结合区(matrix attachment region,MAR)是一种调控基因表达的新型顺式作用元件，具有提高转基因表达、克服转基因沉默、作为DNA复制起始点及参与染色体包装等重要功能，但由于与其作用的反式作用因子尚未阐明，调控机制仍不清楚。申请者前期从盐藻中分离出MAR及结合蛋白MBP,并证实该蛋白能与MAR结合并参与染色体包装等。由于反式作用因子由多种不同蛋白组成，这些蛋白各具功能、相互作用，共同与顺式作用元件相互作用来调控基因的表达，因此我们提出用分离出的MBP"钓取"相互作用蛋白的设想。本项目拟利用酵母双杂交、GST pul1-down等技术筛选与盐藻MBP相互作用的蛋白质及基因、确定与MBP相互作用的关键结构域，用RNAi等技术分析MBP及其相互作用蛋白在染色体包装、基因表达调控中的作用，为阐明顺式作用元件MAR的调控机制提供理论和实验依据。

核基质结合区(matrix attachment region, MAR)是一种调控基因表达的新型顺式作用元件，具有提高转基因表达、克服转基因沉默、作为DNA复制起始点及参与染色体包装等重要功能，但由于与其作用的反式作用蛋白尚未阐明，其调控机制仍不清楚。申请者前期从盐藻中分离出MAR及其结合蛋白(MAR binding protein, MBP)基因,研究证实该蛋白能与MAR结合并能参与染色体包装等。由于反式作用蛋白因子往往不是一种，而是由不同蛋白组成蛋白簇，这些蛋白各具功能，共同与顺式作用元件相互作用来调控基因的表达，因此我们提出“分离MAR结合蛋白组”的设想。本项目首先构建了盐藻酵母双杂交cDNA文库，构建“诱饵”质粒并对自我激活报告基因进行检测，筛选cDNA文库，对筛选出的阳性克隆测序。克隆筛选出的MBP基因，构建原核表达载体，进行原核表达及活性鉴定，EMSA、GST pull-down检测蛋白的DNA结合活性。免疫共沉淀实验验证MBP与相互作用蛋白的相互作用，进行MBP相互作用蛋白关键结构域分析。Real-time RT-PCR、Western blot分析相互作用蛋白在盐藻细胞中的表达，免疫组化检测在细胞内的分布。设计相互作用蛋白的干扰小分子RNA，抑制相关基因的表达。选取干涉效率最高的siRNA转化盐藻细胞，分析细胞分裂时染色质及染色体的变化。结果发现构建的盐藻酵母双杂交cDNA文库符合要求，重组诱饵质粒对宿主菌Y187没有毒性。提取阳性克隆酵母质粒后再与诱饵质粒共转化酵母细胞，最终确定16个阳性克隆。经测序及同源性比对，确定了6个克隆为相互作用蛋白基因。原核表达纯化以后，EMSA实验、GST pull-down 实验结果显示有4个相互作用蛋白显示具有与MAR DNA结合的活性，分别为克隆的MBP1、MBP2、MBP4、MBP6。结构域分析结果显示MBP1的第三个蛋白结构域、MBP2的第一个蛋白结构域序列及MBP6的第二个蛋白结构域序列均与MBP结合较强。MBP的翻译后蛋白质表达存在一个负调控。MBP1、MBP2、 MBP6三种蛋白均为核内蛋白。RNA干扰抑制MBP基因表达后，能够阻止细胞染色体形成与分离，导致细胞G/M期阻滞。总之，本项目通过酵母双杂交技术分离盐藻MAR结合的相互蛋白，并证实了分离的盐藻MBP能够参与细胞染色体的形成。