卵巢高丰度表达的新分子CRF相互作用蛋白的筛选及功能研究

卵巢是女性十分重要的器官，对妇女的生长、发育、生育、健康和生活起着关键性的作用。深入了解卵巢活跃表达的基因将有利于了解卵巢发育及相关疾病调控的分子机制。CRF是C1q家族的一员，与C1q具有相似的结构，前人研究认为CRF主要在脑部表达并参与神经分化。本课题组通过RT-PCR及测序分析首次发现CRF在高等哺乳动物的卵巢组织高丰度表达，进化分析发现在从头索动物到哺乳动物进化的5亿年时间历程中，CRF直系同源基因都在卵巢组织高表达，暗示CRF类基因在卵巢的发育成熟或者与卵巢相关的功能中的重要性。然而目前对于CRF作用机理的研究鲜有报道。为了更深入的了解CRF在卵巢组织中的作用机制，本项目拟以CRF成熟肽作为酵母双杂交系统中的"诱饵"，筛选小鼠卵巢cDNA 文库，寻找与CRF相互作用蛋白，探寻CRF在卵巢组织中的作用机制，为更深入的了解卵巢的发育、卵巢相关的疾病发生及调控提供实验数据及新的思路。

CRF（C1q related factor），又称为C1ql1（C1q like 1），与参与补体活化的C1q具有相似的结构，属于C1qTNF超家族成员，对其功能研究相对较少。迄今为止仅有的5篇关于CRF的报道多集中在探索其在神经系统中的表达情况及可能功能，或者其mRNA剪接方式探讨。本课题立项于CRF直系同源基因在漫长的头索动物到哺乳动物进化的5亿年时间历程中，都在卵巢组织高表达，但其在卵巢组织中的功能未知。本项目实施之初拟通过寻找与CRF相互作用蛋白，并结合分析比较CRF在不同病理生理条件下的表达情况，探寻CRF在卵巢组织中的作用机制。.在本项目的实施过程中，按照计划书的内容采用CRF成熟肽作为酵母双杂交系统中的“诱饵”，4次筛选小鼠卵巢cDNA 文库，仅得到了几个潜在的CRF相互作用蛋白（如C1ql4等），总体筛选结果不理想，没有达到我们预期的目的。CRF mRNA在小鼠的各组织中广泛分布。通过原位杂交对CRF mRNA进一步定位发现CRF mRNA在各级卵泡中都有表达，在颗粒细胞高表达，在卵母细胞表面也能检测到CRF mRNA表达，在卵泡膜也有CRF mRNA表达。原核表达CRF蛋白，并制备了抗血清，通过抗血清检测发现CRF（C1ql1）及其互作的同源蛋白C1ql4蛋白在颗粒细胞及卵母细胞都有高水平表达。通过原核表达系统和真核表达系统制备了CRF及其互作蛋白C1ql4的可溶性蛋白（球状结构域及全长蛋白）。将CRF和C1ql4蛋白处理小鼠颗粒细胞，发现CRF及C1ql4蛋白能够抑制颗粒细胞的凋亡，且球状结构域与全长蛋白具有类似的功能。且CRF 球状结构域蛋白和全长蛋白都能够减缓TNFα诱导的颗粒细胞凋亡，暗示着具有相似三级结构的CRF与TNFα之间存在着功能拮抗作用。经CRF处理后的颗粒细胞的caspase-3和p53表达水平降低，表明CRF能够抑制p53依赖的caspase-3介导的细胞凋亡。CRF 可能对颗粒细胞的存活发挥着抗凋亡的保护作用。.通过本项目的研究，首次揭示了CRF在卵巢组织表达中的作用，对CRF调控卵巢颗粒细胞凋亡的机理进行了初步阐明。该研究对于进一步阐明卵泡闭锁发生的调控机理以及卵巢颗粒细胞凋亡调控失调引起的疾病如多囊卵巢综合症的发病机理及治疗提供了实验数据及新的思路；也为C1q家族基因功能研究提供了新的方向。