尿沉淀细胞DNA甲基化高通量检测方法的研究

设计一组选择探针，每个选择探针的两末端序列与靶DNA两末端特异互补，选择探针的中间序列与通用序列互补。基因组DNA经酶切磁珠富集后产生的高甲基化CpG岛片断与选择探针，通用序列等混在一起，经过杂交、外切、连接成环、Cy3荧光标记的通用引物扩增等步骤，完成对靶序列的选择性多重扩增。丙烯酰胺修饰的甲基化检测探针混合到含有丙烯酰胺单体、丙三醇、过硫酸铵的溶液里，然后点到丙烯基团修饰的玻片上，通过TEMED完成聚合，从而制备成多基因甲基化检测的三维凝胶芯片。芯片与荧光标记的多基因靶DNA杂交后，通过凝胶芯片电泳，去除掉非特异性吸附与杂交，最后通过荧光信号的有无进行甲基化状态的判读。这种选择性扩增结合三维凝胶电泳芯片技术具有固定量大、敏感性高、特异性强、可电泳、多基因并行分析等优点。可用于尿沉淀细胞DNA甲基化高通量检测，为膀胱癌肿瘤标志物的筛选，风险筛查，预后评估等提供了新的检测方法与手段。

按照项目计划的任务和目标，在青年基金的资助下，本项目及时跟踪和运用了最新的高通量测序技术，用SOLiD （Applied Biosystems）技术平台进行膀胱癌相关基因DNA甲基化谱分析和microRNA 表达谱分析。其研究成果主要体现在以下4 个方面：（1）建立与优化了MeDIP-Seq的全基因组甲基化分析方法，结果表明MeDIP 富集高甲基化片断效率的重复性与特异性都非常好，基于泊松分布的搜峰方法可以作为一种可靠、准确的MeDIP-Seq 数据分析工具；（2）MeDIP结合Bisulfit技术用于膀胱癌全基因组甲基化测序研究，结果表明在promotor、exon、intron、intergentic和CpGI方面存在甲基化差异，可在差异基因里寻找肿瘤诊断的甲基化marker（3）膀胱癌microRNA 表达谱分析, 结果表明在肿瘤组织和正常组织中存在miRNA表达差异，可在肿瘤高表达的候选miRNA中，筛选到分子诊断的marker（4）microRNA的无创诊断方法研究，通过设计miRNA定量PCR检测方法，可以从血清中筛选到CRC肿瘤无创诊断的Mir-31和Mir-183分子诊断marker，具有很强的敏感性和特异性。