DNA甲基化的快速高通量检测研究

DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育、肿瘤的生成和抑制，以及人类记忆形成中起着至关重要的作用，是近几年新的研究热点之一。目前关于DNA甲基化研究得最多的是抑癌基因的甲基化和肿瘤的形成。研究表明，基因组甲基化水平的研究和检测可以为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供新的依据。因此，近20年来各种各样的甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的需要。我们针对这个课题提出了一个新颖的检测策略，即先将过渡金属氧化物和配体联用选择性地与DNA链上5-甲基化胞嘧啶生成络合物，再用基于蛋白质纳米孔的单通道电流记录法检测络合后DNA片段上的甲基化状态。与传统方法相比，该方法避免了使用高效液相色谱、限制性内切酶或PCR扩增，且检测结果对DNA序列没有任何依赖性，其简便、快捷和廉价的特点有利于大量样品的快速筛选和高通量平行检测，对促进人类基因组DNA甲基化研究具有重要的意义。

DNA甲基化参与了基因印迹、基因表达调控、生长发育等多项生理过程，在生命活动中起着非常关键的作用。研究表明，DNA甲基化是肿瘤早期诊断的潜在生物标记物，同时也可作为基因治疗的靶向目标。除5-甲基胞嘧啶外，已有研究表明，5-羟甲基胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶在去甲基过程中的一个中间产物，但其同时也在表观遗传重编码及组织相关基因表达调控中扮演着重要角色，从而被称为第六种碱基。由于DNA甲基化在生长发育和疾病监测中的重要性，近年来人们已开发出一系列检测方法。目前常用的方法主要可分为四类，包括亚硫酸氢盐测序、甲基化敏感的限制性内切酶消化、甲基化DNA特异性抗体亲和富集、以及最新发展的单分子测序法。每种方法均有其适用的对象，也各有优缺点。与此同时，5-羟甲基胞嘧啶的检测也受到了空前的关注，其中，氧化亚硫酸氢盐测序法已在单碱基水平上实现5-羟甲基胞嘧啶的定性定量分析。其它更加快速、经济的检测方法也正在积极研究中。..本项目中，我们我们将（羟）甲基化胞嘧啶的选择性化学修饰与主客体相互作用结合起来，实现了5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶在alpha-溶血毒素纳米孔中的定量检测。我们在DNA链中的（羟）甲基化位点特异性修饰上一个主客体复合物（二茂铁<葫芦脲[7]），该杂化体穿越alpha-溶血毒素时能够产生高度特征性的电流信号，从而为5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的有效识别与定量提供依据。本策略不需要聚合酶链反应和甲基化敏感限制性内切酶，也不需要任何测序操作，而仅仅依赖于化学方法的选择性标记与纳米孔单通道记录技术，因此是一种快速而经济的方法，可用于基因组DNA中表观遗传修饰的高通量检测筛选和（羟）甲基化相关疾病的早期诊断。