DNA甲基化的原位检测新方法研究

DNA methylation detection plays an important role in biomedical research. However, the conventional analysis methods are only obtain the average result of the whole subject, ignoring the high heterogeneity of DNA methylation modification. At present, there are only a few methods for in situ detection of DNA methylation on highly repetitive sequences, revealing the spatial changes of DNA methylation modification. However, these methods still have drawbacks such as limitation of detection sequence and high technical difficulty. Herein, we proposed a new approach to detect the DNA methylation of any specific sequence in cells by using the dual-recognition mode combined with the nucleic acid signal amplification. DNA methylation modification in the target sequence is dual-recognized by using the methylated cytosine probe and the target sequences probe. When the dual-recognition occurs simultaneously, nucleic acid signal amplification reaction is triggered by "proximity effect" to realize high sensitive detection of single copy target sequence. This new method will be employed to in situ detect the spatial heterogeneity changes of gene methylation in tumor microenvironment, providing a new method for studying tumor invasion and metastasis.

DNA甲基化检测在生命医学研究中扮演着重要角色，但常规分析方法只是对研究对象整体的平均检测，忽略了DNA甲基化修饰的高度异质性。目前，仅有少数方法可以对高度重复序列上的DNA甲基化进行原位检测，初步揭示了DNA甲基化在空间上的异质性。但这些方法仍存在检测序列局限于高度重复序列、技术难度高等问题。为此，本课题提出采用双重识别模式结合核酸信号扩增的新策略对细胞内任意特定序列的DNA甲基化进行高特异、高灵敏的原位检测。利用甲基化胞嘧啶识别探针和靶序列识别探针对目标序列中的DNA甲基化修饰进行高特异性的双重识别；进而通过探针之间的“邻近效应”触发核酸信号扩增反应，对识别信号进行放大，实现对细胞中单拷贝序列的高灵敏检测。本课题拟利用所建立的方法对肿瘤微环境中相关功能基因甲基化进行原位检测，探索靶标基因的DNA甲基化状态在肿瘤侵袭、转移过程中的空间异质性变化，为研究肿瘤的侵袭、转移提供新的技术手段。

DNA甲基化检测在生命医学研究中扮演重要角色，但常规分析方法只是对研究对象整体的平均检测，忽略了DNA甲基化修饰的高度异质性。目前，仅有少数方法可以对DNA甲基化进行原位检测，但这些方法仍存在检测序列局限于高度重复序列、技术难度高等问题。为此，本课题提出采用双重识别模式结合核酸信号扩增的新策略对细胞内任意特定序列的DNA甲基化进行高特异、高灵敏的原位检测。. 为此，我们首先构建了一种高亲和力的DNA甲基化识别蛋白探针，我们将天然DNA甲基化结合蛋白的核心功能域与链霉亲和素进行融合表达，形成识别蛋白的四聚体，显著提高蛋白与甲基化DNA的亲和力。同时，借助链霉亲和素-生物素系统，该蛋白探针可以很方便的与核酸分子进行偶联，方便后续应用。. 进一步，我们利用甲基化识别蛋白探针和靶序列识别探针对目标序列中的DNA甲基化修饰进行高特异性的双重识别；进而通过探针之间的“邻近效应”触发杂交链式反应，对识别信号进行放大，实现对细胞中DNA甲基化的高灵敏检测。. 此外，针对目前DNA甲基化检测依赖于重亚硫酸盐处理的问题，我们对基于限制性内切酶的DNA甲基化检测方法进行改进，将限制性内切酶技术与数字化分析平台相结合，实现对于微量DNA中甲基化的高灵敏、精确定量检测。同时，将限制性内切酶技术与核酸信号扩增技术相结合，解决了传统基于单纯PCR扩增的酶切甲基化检测方法灵敏度低的问题，通过控制反应温度，实现限制性酶切、PCR扩增和核酸信号扩增过程在单管中一次进行，大大简化了操作。. 另一方面，针对DNA甲基化过程中的重要参与者，DNA甲基化酶，我们建立了一种基于级联核酸侵入反应的DNA生物传感器用于甲基化酶的活性分析。该DNA生物传感器固定在磁珠上，可以通过简单的DNA聚合酶处理后实现传感器再生。. 本课题所创建的DNA甲基化原位检测方法以及DNA甲基化相关生物标志物检测新方法，为DNA甲基化研究提供一个有力工具。