枇杷果肉木质化形成过程的拉曼/红外定量显微可视化研究

Lignification is a process during which the lignin is depositing in cell walls. The lignin measurement of loquat fruit is usually carried out at the tissue level, result in a total lignin content. The formation and development mechanism of lignification of loquat flesh at the cell level, especially at the single cell level, is not clear yet. The present project will use Raman/IR microscopic hyperspectral imaging techniques in tandem with mathematical analysis algorithms to establish a label-free quantitative and microscopic visualization system for displaying the lignin distribution within the cell walls of loquat flesh. The system will be established through a series mathematical works including spectral response analysis, feature extraction, spectral multi-scale fusion and fingerprint information mining. The operation of this system can retain the micro-space structure of cell walls, and therefore will be further used to understand the dynamic change of content/distribution of lignin within the cell walls of loquat flesh processed by different postharvest methods during the lignification process. The results of the present project will provide theoretical and technical supports on further exploring the lignification mechanism of loquat flesh.

木质化主要是木质素在细胞壁沉积的过程。常规枇杷果肉木质素检测方法多在组织水平获得木质素总含量，对于枇杷果肉木质化在细胞水平，特别是单细胞水平的形成和发展机制还不明确。本项目拟采用拉曼/红外显微高光谱成像技术结合数学分析算法，通过开展光谱响应分析、特征提取、光谱多尺度融合和指纹信息挖掘等工作，在保留细胞壁微观空间结构的基础上，构建木质素在枇杷果肉细胞壁上的非标记定量微观可视化体系，明晰不同采后处理下枇杷果肉木质化过程中木质素在细胞壁上的含量/分布动态变化。项目研究旨在为深入探讨枇杷果肉木质化机制提供理论和技术支撑。

木质化主要是木质素在细胞壁沉积的过程。常规枇杷果肉木质素检测方法多在组织水平获得木质素总含量，对于枇杷果肉木质化在细胞水平，特别是单细胞水平的形成和发展机制还不明确。项目开展了枇杷果肉木质化形成过程的定量显微可视化研究。主要研究结果如下：（1）组织水平的木质素染色和自发荧光成像显示‘洛阳青’枇杷果肉中存在大量木质化细胞，该类细胞的木质素含量丰富，而薄壁细胞没有木质素信号。（2）对比了易发生冷害木质化的红肉枇杷‘洛阳青’和不易发生冷害木质化的‘白沙’两个品种果实中木质化细胞分布密度差异。（3）比较了不同切片方式优化样品制备，研究获得了显微拉曼高光谱成像仪器数据采集的最优参数设置。发现冰冻切片可以在尽量保持细胞原有形态的情况下获得高信噪比的显微拉曼图谱。（4）采集了枇杷果肉细胞显微拉曼高光谱，开展了枇杷果肉细胞拉曼图像数据挖掘算法研究。基于自适应迭代再加权最小二乘处罚（aiPLS）算法实现了拉曼高光谱背景扣除，基于高斯拟合算法实现了枇杷果实拉曼重叠谱峰的分解，基于拉曼全谱相关性分析算法，明确了1335 cm-1波峰归属于木质素的吸收峰。（5）获取了主要细胞壁物质标准品拉曼光谱，并对枇杷果肉细胞拉曼光谱进行了谱峰归属，其中1664， 1628， 1603， 1467和1272 cm-1归属于木质素。分析了木质素定量微观可视化体系实现的光学响应机理。（6）构建了枇杷果肉细胞中木质素空间分布成像体系，获得了枇杷果肉细胞的木质素分布图。显微拉曼成像结果显示，木质素分布于整个木质化细胞，而薄壁细胞没有木质素分布。进一步获得了不同阶段的枇杷果肉木质素动态变化分布图；（7）对枇杷果肉木质素分布显微拉曼高光谱成像进行可靠性验证。本研究结果丰富了枇杷木质化研究的生物学理论，在宏观组织含量测定分析和分子生物学之间补充了细胞水平研究，为深入探讨枇杷果肉木质化机制提供理论和技术支撑。