类水滑石纳米材料作为植物细胞跨膜载体的应用研究

One of the most challenging technical problems in the research of cell biology is to transfer the biomolecules into the intact cells with high efficiency and accuracy. The advanced nanotechnology provided various resolutions to conquer this difficulty. In the field of animal cell biological researches, the nanomaterials have been introduced into the routine laboratory works as efficient molecular transmembrane transporters. However, the compact plant cell walls prevented these transporters for reaching the cell membrane. Therefore, only limited approaches were provided in the research of plant molecular and cellular biology. In our previous works, we synthesized layered double hydroxide nanosheets (LDH) with 0.5 nm thickness and 20-50 nm diameters. We found that these LDH based on Mg/Al cations can absorb the DNA and other negative charged molecules with high efficiency. Furthermore, it can easily penetrate the cell wall and transfer these molecules into intact plant cells. In this project, we will study the molecule mechanism of LDH transmembrane transport and establish a computational model for the LDH transmembrane transport. Based on this model, we will improve the formation of the LDH nanosheets and provide an optimal experimental approach for the research of plant molecule and cell biology. Moreover, this method may be widely used the transformation of non-model plants in agriculture and forestry applications.

如何将生物大分子高效、准确且保持活性地运输至活细胞内仍是细胞生物学研究中的关键性技术难题之一。纳米科技的发展为解决该问题提供了多种有效研究手段。在动物细胞生物学基础研究领域，纳米材料已成为实验室常用的，协助分子跨膜转运的有力工具。然而，致密的植物细胞壁阻碍多种无机或有机载体进入细胞，这使得在植物细胞与分子生物学研究领域可供选择的技术手段相对贫乏。我们在前期制备了厚度0.5nm，直径20-50nm的Mg/Al阳离子类水滑石二维片层材料（LDH），并发现LDH具有高效吸附DNA等生物活性分子，且能轻易透过植物细胞壁，携带核酸和荧光染料等进入完整植物细胞中的独特能力。本研究将进一步揭示LDH跨膜转运的分子机制，建立LDH在细胞中转运的分子模型。在此基础上，改造LDH结构，优化实验方法，以期为植物分子和细胞生物学研究提供一种新的分子载体，也将为农林业中重要的非模式植物提供新的细胞转化方法。

本研究力图开发一种基于类水滑石纳米片层材料(LDH)的，可以通过植物致密细胞壁的，广谱、高效、快速和廉价的植物分子生物学技术。本研究发现，可以通过调整剥离温度，获得直径不一的，以乳酸根为插层的Mg-Al-LDH单片层结构。其中，30-60nm直径的单片层LDH，具有最佳的核酸吸附效率和携带核酸材料进入植物细胞内的效率。通过计算机建模研究，发现这是因为DNA与LDH形成DNA-LDH-DNA的三明治结构才能有效地穿透细胞膜。因此，适宜的表面积和电荷数都是成功将LDH应用于植物细胞分子生物学研究的关键。我们据此优化了实验条件，即以LDH:DNA = 1:5的质量比例制成处理液，在拟南芥、烟草等模式植物中，使处理液中LDH浓度达到50mg/ml，能获得最佳转化效果。.我们还研究了这样的纳米材料对植物细胞毒性。Mg-Al-LDH能显著降低其中Al离子带来的细胞毒性。在50mg/ml的工作浓度下，MgLac和AlLac混合液将对拟南芥根生长造成显著抑制作用；同时，300mg/ml的Mg-Al-LDH才会对植物细胞产生毒害作用。我们可以看到，该纳米材料对植物细胞无显著毒害作用。.利用原子力显微镜，我们对结合DNA以后的LDH也进行了观察。发现质粒大小的长片段DNA容易缠绕并阻止其通过植物细胞壁。因此，将LDH携带生物大分子的实验主要集中在了对小片段RNA的应用上。在研究中，我们成功使用LDH携带miRNA，siRNA，dsRNA，circRNA，以及lncRNA对其靶基因表达进行干扰和调控。该研究也得到了第三方实验室的验证。最后，我们还根据科技最新进展，在杨树中建立了CRISPR/CAS9空载株系，利用LDH携带gsRNA进入杨树细胞，成功获得基因编辑植株。大大方便了CRISPR基因编辑技术在植物细胞中的应用方法。该项目基本完全完成了项目目标，部分结果尚在准备发表中，将在一年内完成发表和专利申报工作。现申请结题。