植物向光素phot1调控的内吞信号支路的研究

In-depth study of plant light-sensing mechanism not only has a high theoretical value, but also a potential value in the application field of agriculture and forestry. In previous studies, we found that the plant membrane photoreceptors, phot1, mediated a blue light-dependent vesicular endocytosis, which reflects the signal intensity and duration from blue light. Moreover, the phot1 and its crucial signal transducer, NPH3, can also adjust the root polar auxin transport by regulating the PIN2 endosomal recycling. Based on these results, we will draw lessons from the new theory of signalsome-mediated endocytosis from the animal cell biology. We will quantitatively analyze the aggregation and clustering of phot1 and NPH3 through application of advanced protein marking, tracing and single-molecule analysing technology, revealing the relationship between these dynamic behaviours and blue light signal intensities. Furthermore, we will also use the FRET and FCCS technologies to observe and analyze the protein interaction behaviours between phot1, NPH3 and the small G-protein, ARF1 in living cells. All together, this study will establish a new mode of investigation to analyze the role of plasma membrane in the regulation of different environmental signals.

对植物感光机制的深入研究不仅具有较高理论价值，还在农林业应用上具有潜在价值。我们发现，植物膜受体向光素phot1介导的内膜囊泡效率和蓝光信号强度相关。 并且，phot1及其关键的信号转导蛋白NPH3还能通过影响PIN2的内膜循环来调控拟南芥根尖的生长素极性运输。根据这些前期结果，我们将借鉴动物细胞生物学上的信号小体（Signalsome）的聚集和控制内吞囊泡形成与循环的理论，通过应用新兴的蛋白质标记、示踪和单分子定量分析技术，在生理条件下实时观测并定量研究蓝光信号强度和phot1/NPH3的聚集、内吞过程。此外，还将利用在活细胞中实时动态和定量观测荧光标记的蛋白分子间互作模式的FRET与FCCS技术，研究phot1，NPH3与内膜运输的关键蛋白ARF1之间的互作模式，为探索植物细胞膜在响应环境信号的调控作用奠定理论基础。

在本研究中，我们依托自然科学基金的资助，在项目任务书的研究框架下，根据实验实际进展和跟踪国际最新文献报道，在植物感光的分子机制方面做出以下成绩：.我们在拟南芥蓝光受体的GFP 标记蛋白PHOT1-GFP以及其激酶结构域失活点突变蛋白PROPHOT1::PHOT1D806N-GFP的基础上，利用可变角全内反射荧光显微镜 (variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy，VA-TIRFM)等新型研究技术，进行了单分子观测和分析，在高时空分辨率的水平上，揭示了膜上蓝光受体PHOT1的动态变化规律，以及对其活性的调控机制。通过检测了蓝光受体PHOT1在细胞质膜上的运动状态，发现PHOT1-GFP的运动是以计量依赖的模式受到蓝光的调控；PHOT1的自身磷酸化发生在光诱导的受体聚合之后，经过自身磷酸化的PHOT1在膜上的扩散加快并且发生胞吞。此外，膜微区在PHOT1介导的信号传递过程中起着重要作用。这些结果为研究PHOT1自身和所处微环境对蓝光信号传递的影响提供了新见解。