益气活血法协同调控PI3K/AKT信号通路的脑缺血神经保护机制研究

The core problem of cerebral ischemia is the nerve dysfunction caused by neuronal damage,againsting the apoptosis of neuron has become a key link in the disease treatment.Traditional Chinese medicine believes that Qi deficiency and blood stasis is a main pathogenesis of ischemic encephalopathy, so the main rules of treatment is Yiqi Huoxue therapy , with the combination of Astragalus and Erigeron breviscapus in clinical can significantly improve neurological system symptom of the disease, and previous studies have already proved synergistic effect on ischemic nerve cell survival in vitro of their combination, but the synergism mechanism of its neuroprotection is not clear. Based on the important role in the modulation of PI3-K/Akt signal pathway in the process of nerve cells apoptosis after cerebral ischemic injury. we hypotheses that regulating PI3-K/Akt pathway to resist the nerve cell apoptosis is the important mechanism of Yiqi Huoxue therapy to achieve brain protection Therefore, we will establish qi deficiency and blood stasis syndrome with local cerebral ischemia reperfusion model,then quantitatively describe the correlation between components ratio and neuroprotection to make clear the optimum ratio.Thereby,the components of Astragalus and Erigeron breviscapus coordinately control the protein expression of BDNF,NGF,PI3-K,PIP3,p-Akt and Bad as well as GSK3βby immunohistochemistry and Western blot technology. These results would figure out the important neuroprotective mechanism of Yiqi Huoxue therapy and provide a new way for the research on neuroprotectionan of cerebral ischemia.

神经元损害是缺血性脑病引起神经功能障碍的重要原因，对抗神经元凋亡已成为该病救治的关键环节。中医学认为气虚血瘀是该病的主要病机，常以益气活血法治之，临床将黄芪、灯盏细辛联用能显著改善神经功能障碍，但其神经保护机制尚不明确。基于PI3-K/Akt信号通路是调控脑缺血神经细胞凋亡的重要通路，本项目提出“协同调控PI3-K/Akt通路对抗神经元凋亡是益气活血法实现脑缺血神经保护的重要机制”假说。拟建立气虚血瘀证脑缺血再灌注动物模型，运用基线等比增减设计-偏最小二乘回归数理模型，定量描述“黄芪-灯盏细辛”组分配比与神经保护的相关性，在此基础上运用神经生理、免疫组化、western blot等技术，探究其对PI3-K/Akt通路中NGF、BDNF、PI3-K、PIP3、p-Akt、GSK3β、Bad等关键蛋白表达的协同调控作用，揭示益气活血法的脑神经保护重要机制，为寻找理想的脑神经保护剂提供新策略。

本项目对传统方法与肾上腺素诱导制备大、小鼠气虚血瘀证的造模效果进行了对比考察。结果表明，后者在两种动物上的成模率均较高，拟选定为气虚血瘀模型的造模方法。在此基础上，将其与线栓法脑缺血损伤模型结合，最终建立了气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型，为后续药效与机制研究奠定了实验基础，对于同类研究也有一定借鉴价值。. 以气虚血瘀证大鼠模型和线栓法脑缺血大鼠模型，对比评价了黄芪-灯盏细辛不同配比的改善气虚血瘀证和脑神经保护作用。结果表明，与模型组比较，除黄芪外，各组均显著延长凝血时间，同时显著降低TG、T-CHO、LDL-C水平，且以黄：灯（3:7）作用突出；各药物组能改善神经行为评分，不同程度降低脑梗死率，明显升高SOD 或降低MDA含量，以3:7综合表现较好。采用病证结合的气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型，结合基线等比增减设计，对比不同配比黄芪-灯盏细辛的脑神经保护作用。结果表明，各给药组均能不同程度降低大鼠神经学评分、脑梗死率，升高SOD 或降低MDA水平，两药联用具有明显协同作用，其中以4∶6组疗效最为显著。该研究证实了两者临床合用的科学性，并为其配伍使用提供了实验依据。. 以优选的黄芪、灯盏细辛最佳配比4:6为对象，研究其对PI3/AKT通路中PI3K、AKT、BAD等关键蛋白的调控作用。结果表明，与模型组比较，黄芪、灯盏、4:6给药组对大脑皮层与海马组织中PI3K均有促表达作用，特别是4:6给药组对PI3K的刺激作用最为显著；各给药组均能促进大脑皮层组织AKT表达，差异显著，同时对海马组织中的AKT表达仅4:6给药组作用显著；各给药组对大脑皮层组织中BAD表达均表现出一定抑制作用，其中4：6给药组差异显著，而海马组织中BAD基本没有表达。本研究表明，两者联用可通过促进PI3K、AKT表达，并抑制BAD表达，以激活PI3/AKT通路而产生抗脑缺血神经损伤作用，初步证实了协同调控PI3-K/Akt 通路对抗神经元凋亡是益气活血法指导下黄芪-灯盏细辛联用实现脑缺血神经保护的重要机制这一假说。