转运siRNA的光敏九聚精氨酸制导长循环脂质体的构建与评价

As a new gene therapy , targeted delivery of siRNA and silence efficiency are one of the key techniques for clinical therapy of siRNA. Cell penetrating peptides (R9) constitute as a very promising tool for increasing silence efficiency. Our previously work results show that the R9 Long-circulating Liposomes (R9LL) can increase silence efficiency. However, it limits the R9LL in vivo use for siRNA delivery applications, due to lack of cell specificity. On our previous basic work, in accordance with the design ideas of the "light switch", we will devise a strategy for site-specific delivery of siRNA into cancer cells by using liposomes bearing a light activated caged R9 (LR9LL). Once illuminated by light, these protecting groups are cleaved, the R9 regaines its activity and facilitated rapid intracellular delivery of the liposomes-siRNA conjugates into cancer cells. This research focuses around the content of LR9 to carry out a systematic study of the quality and activity of LR9LL. We may achieve that siRNA is specifically delivered into tumor cells by LR9LL. We will obtain excellent result which provides a better protection for siRNA, a better target for tumor and a better gene silencing ability by the study.

将siRNA靶向递送至肿瘤细胞内并有效发挥基因沉默效率是肿瘤基因治疗时面临的一个重要的问题。细胞穿透肽（九聚精氨酸）的应用为提高基因沉默效率提供了方法。我们的前期研究结果显示九聚精氨酸修饰的长循环脂质体(R9LL)可以显著提高基因沉默效率。但由于R9LL缺乏靶向性限制了进一步应用。本课题在前期研究基础上，按照"光开关"的设计思路，利用光敏保护基团掩蔽R9，构建光敏九聚精氨酸长循环制导脂质体(LR9LL)。在避光区域时LR9LL处于钝化状态，当处在被光照射的肿瘤部位时LR9LL脱去光敏保护基团，暴露出R9LL（激活状态），将包裹的siRNA大量导入肿瘤细胞，实现对肿瘤组织靶向递送、肿瘤细胞高效导入的目的。本项目重点围绕光敏九聚精氨酸(LR9)的含量对LR9LL的性质及体内外活性的影响开展系统性研究，为筛选出靶向性更好、基因沉默效率更高的siRNA递送载体提供理论和实验依据。

完整地将生物大分子（如siRNA等）递送至靶细胞内的作用靶点是这些物质能否成功地用于重大疾病的预防和治疗的关键。然而，生物膜的天然疏水性限制了将生物大分子直接向胞内递送。能够穿透细胞膜并进到细胞内的细胞穿透肽（CPP）的发现为解决生物大分子进入细胞提供了方法。但是CPP缺乏组织和细胞的特异性，限制了其应用。近年来，随着光动力治疗（PDT）广泛应用于临床，光触发纳米药物递送系统的研究逐渐受到重视。相对于紫外光，红外光穿透能力更强、安全性更好。据此，在前人研基础上，本研究构建了可被红外光触发激活的“光开关”式细胞穿透肽（photolabile-caged cell-penetrating peptide，pcCPP）修饰和NGR肽辅助修饰的阳离子脂质体（pcCPP/NGR-LP）作为siRNA的递送载体。在研究中，我们利用光敏感保护基团（PG）暂时抑制CPP的透膜能力（钝化）合成了pcCPP。给药后，pcCPP/NGR-LP在NGR肽介导下，向CD13高表达的肿瘤细胞主动聚集，此时pcCPP处于钝化状态；当pcCPP/NGR-LP到达肿瘤部位后，对肿瘤部位光照，pcCPP发生光解反应，PG脱落，进而暴露出CPP（活化）；最终，在CPP的介导下，pcCPP/NGR-LP进入肿瘤细胞并将siRNA在胞浆中释放。研究结果表明：（1）pcCPP/NGR-LP可显著增加siRNA向HT-1080肿瘤细胞的传递效率，并使其成功逃逸内涵体，分布于胞浆；（2）pcCPP/NGR-LP可有效增强HT-1080肿瘤细胞凋亡的诱导能力，与mRNA和蛋白水平上c-myc的基因沉默效应保持较好的一致性；（3）pcCPP/NGR-LP能够显著提高siRNA的体内肿瘤靶向性；（4）pcCPP/NGR-LP可达到显著的荷HT-1080裸鼠肿瘤抑制效果和肿瘤细胞凋亡，这一作用与瘤内c-myc表达水平的降低密切相关。因此，pcCPP/NGR-LP作为一种新型递送载体，显示了较理想的细胞及动物模型水平的抗肿瘤效果。基于上述结果，本研究利用pcCPP选择性地将生物大分子递送到靶细胞内是一种新的药物递送思路，是解决生物大分子进入靶细胞的关键问题的有效方法，为大分子给药系统的研究提供了新的思路。