漆酶在荔枝果皮单宁缩合及果皮褐变中的作用

Rapid pericarp browning of Litchi （Litchi Chinensis）fruit after harvest has drawn intensive studies. However, the mechanism leading to the browning is still unclear. We had identified a laccase (ADE/LAC) that was responsible for the rapid browning and the enzyme catalyzed epicatechin oxidation mediated degradation of anthocyanins. ADE/LAC showed high activity to epicatechin, implying that it may function in the polymerization of tannin during the pericarp browning. Based on this hypothesis, the present project aims to explore the browning mechanism in the aspect of tannin polymerization. The project focuses on the study of the important role of laccases on tannin polymerization and browning via molecule genetics and biochemistry approaches, the relation between tannin polymerization and browning, and the degree of tannin polymerization and browning products. The study will help people to understand the mechanism of tannin polymerization in plants and to understand the rapid browning.

荔枝果皮褐变速度之快，在采后果实中极为罕见，是长期困扰着采后生理学家们的一个难点问题，国内外对荔枝果皮褐变机理做过大量而广泛的研究，但仍然未能提出令人满意的解释。我们首次发现一个高活力的漆酶（ADE/LAC）在荔枝果皮迅速褐变中起关键作用，该酶可催化表儿茶素（一个单宁单体）与花色素苷的协同氧化，从而推测漆酶可能在缩合单宁聚合及延长过程中起核心作用，并进而导致果皮迅速褐变。本项目针对这一假说，拟从单宁缩合机制的角度探讨荔枝果皮褐变机理。重点利用分子遗传及生化手段研究漆酶在单宁聚合及延长过程中的核心作用，探讨单宁的缩合过程与果皮褐变的关系，单宁的缩合度与褐色物质色泽及果皮褐变程度的关系。本项目研究成果一方面有利于人们理解长期以来植物界尚未清楚的单宁的缩合机理，另一方面，有助于人们从一个全新的角度理解荔枝果皮迅速褐变机理这一难题，为采后果蔬褐变机理研究提供新的思路。

采后荔枝果皮迅速褐变，是限制果实贮藏运输和市场开拓的主要因素。目前人们对荔枝果皮褐变机理仍未完全清楚。我们之前发现一个高活力的漆酶（ADE/LAC）在荔枝果皮迅速褐变中起关键作用，该酶可催化表儿茶素（一个单宁单体）与花色素苷的协同氧化，本项目从漆酶介导的单宁聚合角度探讨荔枝果皮褐变机理。主要结果如下：（1）我们发现荔枝果皮多种单宁（包括表儿茶素、PC A2/B1/B2/C1）及主要类黄酮物质（花色素苷及芦丁）含量随褐变而减少；（2）荔枝果皮的主要漆酶（ADE/LAC）对上述单宁物质具有活力，其中表儿茶素其是漆酶的最适天然底物；（3）漆酶氧化单宁物质可形成褐色产物，其中以表儿茶素（EC）和PC B2为底物时，UPLC-MS/MS分析发现形成二聚体、三聚体和四聚体单宁物质；（4）在E-ADE/LAC反应体系中添加花色素苷和芦丁时，发现形成了花色素苷-EC和芦丁-EC聚合物，形成类似果皮褐变颜色的沉淀；（5）ADE/LAC基因回补拟南芥LAC15突变体（tt10），可以恢复野生型褐色种皮的表型；（6）对荔枝果皮进行转录组分析，发现共26个漆酶在荔枝果皮中表达，分为6个亚族，其中与拟南芥LAC15同源C6亚族成员最多，与褐变密切相关。综上所述，本课题研究发现荔枝果皮含高活力的漆酶和丰富的单宁物质，漆酶氧化单宁聚合在荔枝果皮褐变中起重要作用，从单宁聚合的角度丰富了荔枝果皮褐变机理，也为采后果蔬褐变机理研究提供新的思路。