抗菌肽分子设计及其表达平台的构建

Previously, we have designed and optimized α-helix and β-sheet antimicrobial peptides, and exploited the relationship between structure and function. A few optimized or ideal peptide sequences were obtained. In this study, we further optimize these excellent antimicrobial peptides by tuning physicochemical parameters, such as charge, length, hydrophobicity, hydrophobic moment, second structure, et al., and evaluate the in vitro and in vivo antimicrobial activity, with the aim to obtain optimal peptide sequence of best cell selectivity. Then, different protein expression system, such as Escherichia. coli, Pichia pastoris, Bacillus subtilis, Aspergillus niger, will be constructed, and the optimal peptide sequences will be expressed. The in vitro and iv vivo biological activity of the expressed antimicrobial peptides will be evaluated, and we believe that this work will further lay the foundation for the application of antimicrobial peptides to substitute antibiotics in the future.

本课题组已于前期对α-螺旋和β-折叠抗菌肽进行了结构改造，探讨了其结构和功能的关系，有了扎实的工作基础。为了进一步筛选出优异抗菌肽并产量化，本研究将在原有研究基础上，通过长度、净电荷、疏水性、疏水力矩、二级结构、环化等参数约束抗菌肽的氨基酸一级和二级结构，通过体内、外生物学活性测定，筛选出2-3种优秀的抗菌肽分子。将抗菌肽分子在大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、黑曲霉等表达系统进行平台构建，最终筛选出理想的系统进行发酵罐扩大试验，并进行动物体内实验，评价其体内生物学效价，为抗菌肽的生产和应用奠定基础。

滥用抗生素破坏畜禽肠道微生物菌群的平衡，导致细菌基因突变、药物残留、耐药菌株数量增加，对环境造成潜在危害。因此，研究开发新型抗菌药物的问题已亟待重点解决。抗菌肽被认为是替代传统抗生素的新型潜在抗菌药物，在畜牧业具有广阔的应用前景。. 本研究以PMAP-36为模板，通过优化相关结构参数，如两亲性、结构倾向性等对其进行改良，在此基础上测定了改良肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R的抗菌活性和作用机理；筛选出具有特异性抗绿脓杆菌肽T9W，评估了T9W抗绿脓杆菌效果；基于T9W序列特征，全新设计一系列含有七肽重复序列的抗菌肽，比较了这些肽在抗绿脓杆菌和作用机制方面的差异。. 利用枯草芽孢杆菌表达系统高效重组表达具有活性的抗菌肽Plectasin，设计了融合目的基因SPsacB-6×His-SUMO-Plectasin，将穿梭表达载体pGJ148及融合目的基因经EcoR I和BamH I双酶切作用后，进行连接以构建重组表达载体，将重组载体转化至宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，成功构建重组表达载体PGJ148/SPsacB-6×His-SUMO-Plectasin，并利用化学转化方法转入枯草芽孢杆菌WB800N中，通过麦芽糖诱导，使融合基因成功表达。. 选用组氨酸缺陷型毕赤酵母菌株GS115作为宿主，重组表达抗菌肽PRW4。根据毕赤酵母密码子偏好性，合成优化的编码抗菌肽PRW4的基因序列，在PRW4序列的N端添加His-Trx融合标签，利用毕赤酵母表达载体pPICZαA，通过亚克隆方法构建重组毕赤酵母表达载体pPICZαA-PRW4，电转化至毕赤酵母GS115，转化后挑取单菌落进行培养，通过PCR和测序进行鉴定，并通过甲醇诱导PRW4重组蛋白的表达，用SDS-PAGE鉴定所表达的重组蛋白，并检测重组蛋白的生物学活性。. 此研究为研制新型抗生素提供优良的候选抗菌肽，为有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性等方面具有重要借鉴和参考意义。