抗酶解抗菌肽的研究

Breeding without antibiotics has gradually become the future direction of livestock husbandry. Antimicrobial peptides (AMPs) have showed enormous potential for addressing mounting global antibiotic resistance, however, their application in livestock production and clinical treatment were hindered by their low activity, high toxicity, poor enzyme stability and high manufacturing cost. Our group has conducted a series of studies about the design and molecular modification of AMPs before, with a detailed understanding of their structure-activity relationship. Based on the original research, this study will design or modify AMPs with high activity and safety according to amino acid properties, structural and functional relationships, and protein engineering. At the same time, we will take reasonable measures to avoid the protease specific digestion, such as special structural conformation and avoidance of restriction sites. Then the expression system and fermentation conditions will be optimized to achieve the high-yield and low-cost expression of the target AMPs, so as to realize the substitution of the bio-peptide preparations on the antibiotics in livestock and poultry breeding.

无抗养殖已逐渐成为畜牧业未来的发展方向。抗菌肽在应对抗生素耐药性方面表现出巨大的潜力，但是其在畜牧生产和临床治疗中的应用受到低活性，高毒性，体内酶稳定性较差，生产成本较高等方面的限制。本课题组已于前期进行了一系列抗菌肽的全新设计和分子改造工作，对抗菌肽的构效关系有了细致的了解。本研究将在原基础之上，根据氨基酸属性、结构功能关系和蛋白质工程改造或全新设计具有高活性和安全性的抗菌肽产品，同时结合特殊结构构象，活性中心空间阻隔等方法合理规避蛋白酶的特异性酶切，改善抗菌肽对蛋白酶的耐受力，然后利用表达体系和发酵条件优化实现抗菌肽高产量低成本表达，实现生物肽制剂在畜禽养殖中对抗生素的替代作用。

对消化蛋白酶敏感一直是抗菌肽饲用过程中最大的障碍。本项目将蛋白酶酶切位点理论和纳米化技术紧密结合，通过蛋白酶抑制剂连接、组氨酸或非天然氨基酸修饰、纳米化改造、氨基酸保护等方法合理规避消化道常见蛋白酶的特异性酶切位点，改造或全新设计出对蛋白酶具有高度耐受力的抗酶解肽，系统解决抗菌肽饲喂难题：（1）将天然向日葵胰蛋白酶抑制剂1结合环连接于序列模板碳端构建抗酶解抗菌肽，筛选得到的抗酶解肽RV3对2 mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶均具有一定的抵抗力；（2）选用组氨酸作为正电荷氨基酸，规避胰蛋白酶酶切位点，并通过pH诱导方式控制抗菌肽自身抗菌活性；（3）系统性评价不同策略对提高抗菌肽蛋白酶稳定性的有效性，发现Dab修饰是提高抗菌肽胰蛋白酶稳定性最有效的策略；（4）通过聚乙二醇修饰和树桩大分子设计构建纳米肽微粒，大幅提高多肽对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抵抗作用；（5）基于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶的特异性酶切位点和特殊氨基酸对于酶切位点的空间位阻效应，通过氨基酸的系统排列合理规避蛋白酶酶切位点，设计并筛选出完全由天然氨基酸构成的抗酶解抗菌肽II-I4-II和R7I，两者均可以抵御高浓度胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶的水解作用，其中R7I口服后在肠道中停留时间超过4h,并对小鼠细菌性肠炎具有优异的治疗效果。本项目研究成果突破了饲用抗菌肽的应用瓶颈，为饲用抗菌肽的进一步推广应用奠定了理论和物质基础。