丹酚酸B盐对腺相关病毒转导治疗基因抗肝纤维化的协同作用及其分子机制研究

With the discovery of anti-fibrosis genes,gene therapy became one important strategy to treat liver fibrosis. Adeno associated virus is a human parvovirus, which has high security, infects widely, causes a very mild immune response, and has been used in treating liver fibrosis. But its infection efficiency is not so high. We created a new AAV vector by point mutation, which can infect cells more effectively. It was proved that inhibiting of NF-kB pathway can increase the infection efficiency of AAV. Danshen is a famous herb for treating liver fibrosis. We demonstrated that salvianolic acid B, which is the main component of dansen and can suppress the NF-KB pathway, has anti-fibrosis effect certainly. Therefore,can infection effeciency be increased of AAV in the presence of salvianolic acid B ?and can combining them surpress liver fibrosis synergistically? Therefore, we will combine salvianolic acid B with AAV and observe the effect of salvianolic acid B on infection efficiency of AAV, and the dual effect of salvianolic acid B and AAV carried therapeutic genes on rats with liver fibrosis. Meanwhile,to research the molecular mechanism through NF-kB pathway. The knowledge gained from these studies will lead to the development of novel strategies for the combined use of traditional chinese medicine and gene therapy in the future and find muti-pathes and synergy of chinese medicine effective constituents on liver fibrosis.

随着具明确抗肝纤维化作用的基因被陆续发现，基因治疗已成为抗肝脏纤维化重要策略之一。腺相关病毒（AAV）安全性高、宿主范围广、免疫源性弱，已被开始用于肝纤维化的基因治疗，但感染效率不高限制了进一步应用。我们通过构建外壳蛋白定点突变的AAV载体显著提高了AAV的感染效率，并发现抑制NF-kB通路是提高AAV感染效率的关键环节。丹参为抗纤维化有效中药，丹酚酸B盐是其主要活性成分。课题组前期发现，丹酚酸B盐不仅具有良好抗肝纤维化作用，还可明显抑制NF-kB活性。因此，通过丹酚酸B盐联合腺相关病毒转导治疗基因，是否可进一步提高AAV的感染效率？并通过发挥协同抗纤维化作用而提高整体疗效？本课题拟通过复制肝纤维化大鼠模型，联合使用丹酚酸B盐及携带治疗基因AAV进行干预，观察前者对AAV转导效率的影响及两者抗肝纤维化的协同作用，从NF-kB通路探讨其机制，研究中药有效成分抗肝纤维化多途径协同增效作用。

随着具明确抗肝纤维化作用的基因被陆续发现，基因治疗已成为抗肝脏纤维化重要策略之一。腺相关病毒（AAV）安全性高、宿主范围广、免疫源性弱，已被开始用于肝纤维化的基因治疗，但感染效率不高限制了进一步应用。我们通过构建外壳蛋白定点突变的AAV载体显著提高了AAV的感染效率，并发现抑制NF-kB通路是提高AAV感染效率的关键环节。已经发现携带BMP7基因的治疗载体能够抑制肝纤维化。丹酚酸B盐是具有良好抗肝纤维化作用的单体，还可明显抑制NF-kB活性。本课题将两者联合应用，观察对肝纤维化是否具有协同作用。.本课题首先对AAV的外壳蛋白三个基因位点进行了突变（T492V，Y705F，Y731F），对优化了AAV载体，明显提高了其转染T6、小鼠肝脏的效率。构建了AAV-3M-bmp7治疗病毒并明确其抑制小鼠肝纤维化模型的作用及其工作浓度。复制胆管结扎的肝纤维化小鼠模型，设立假手术组、模型组、丹酚酸B盐组（10mg/kg，腹腔注射）、AAV （AAV-3M-bmp7，3*1012vps，尾静脉注射、联合用药组，共干预2w。结果显示：经AAV治疗后，AAV组和联合用药组血清BMP含量均明显升高，联合用药组高于AAV组（P>0.05）；三个用药组均能明显改善肝纤维化小鼠的肝功能、降低肝组织I型胶原的沉积、降低血清羟脯氨酸含量、降低血清LN和HA含量等，与模型组比较，差异显著（P<0.01），其中以联合用药组最为明显（与两个单独用药组比较，P<0.05）。提示丹酚酸B盐与携带bmp7的AAV对胆管结扎的小鼠肝纤维化具有协同抑制作用。进一步研究发现，三个用药组均能明显降低胆管结扎后沉积的ａ-SMA、降低明显升高的TGF-β、TGF-βR蛋白的表达、降低胆管结扎后明显升高的NF-κB的蛋白及mRNA的表达（P<0.01），其中以联合用药组最为明显（P<0.05）。提示丹酚酸B盐与携带bmp7的AAV对胆管结扎的小鼠肝纤维化协同抑制作用与NF-κB通路有关。本课题将丹酚酸B盐与基因治疗联用，研究了中药有效成分抗肝纤维化多途径协同增效作用，扩大了中药的应用范围，为抗肝纤维化药物的研发以及中医药的现代化研究提供了数据支持。