HCMV感染致人星形胶质细胞分泌变化及其对神经元存活与功能的影响

本项目首先拟用HCMV AD169株感染原代培养的人胚胎星形胶质细胞，应用SuperArray PCR基因芯片、RT-PCR和Western blot技术，研究HCMV感染是否激活并引起星形胶质细胞细胞因子、神经营养素和与突触形成相关蛋白的分泌变化，并确定细胞因子的类型。其次建立星形胶质细胞细胞和神经元共培养体系，通过RT-PCR和Western blot技术检测HCMV感染星形胶质细胞对神经元相应因子受体表达的影响；通过MTT法、流式细胞术检测HCMV感染星形胶质细胞对神经元凋亡的影响；通过免疫细胞化学、透射电镜和全细胞膜片钳技术检测HCMV感染AS对神经元突触形成和突触传递功能的影响。为阐明AS在HCMV感染的神经致病性机制中的作用提供一定的理论和实验依据。

人类巨细胞病毒(HCMV)是造成人类宫内感染并导致中枢神经系统先天性异常的主要病原体之一，迄今为止，HCMV引起神经系统损伤的机制尚未阐明。本项目在以下方面进行了相关研究：.1.原代培养人胚胎星形胶质细胞（AS），通过全基因转录谱分析、RT-qPCR、Western bloting、免疫荧光 以及ELISA方法检测HCMV感染不同时间段AS内细胞因子、神经营养素、与神经元突触形成相关蛋白的表达变化；2.采用同位素摄取的方法观察HCMV感染对AS谷氨酸摄取的影响；通过RT-PCR, Western bloting等方法检测AS内与谷氨酸代谢相关GLT-1、GLAST和GS的表达变化；通过免疫比浊法检测GS酶活性。3.建立AS与神经元共培养系统，通过Western bloting、免疫荧光等方法研究由HCMV感染引起的AS分泌变化对神经元存活、凋亡、突触形成和功能的影响。.本研究结果显示：.1、成功建立人胚胎AS、人海马神经元原代培养、人AS与神经元共培养系统和HCMV AD169体外感染AS模型。.2、有利于神经元和胶质细胞生长、修复和发育的重要生长因子、神经肽类和突触相关基因在感染后72h多数表达下调，同时，在下调基因中发现，参与谷氨酸谷氨酰胺循环的基因表达下调。RT-qPCR验证结果与芯片结果表达变化一致。.3、HCMV感染抑制星形胶质细胞分泌促突触形成分子-TSP1、TSP2 ：24h开始 TSP2 mRNA表达递减，48h开始，TSP1 mRNA表达递减；TSP1和TSP2蛋白分别在72和和48h明显下降。.4、感染下调星形胶质细胞神经突起导向因子-4（netrin-4）的表达。.5、HCMV感染减少AS谷氨酸摄取； HCMV感染96h后，GLT-1 、GLAST和GS表达下降，GS酶活性从6 h到72 h呈上升状态，96 h后下降，至120 h下降2倍以上。.6、HCMV通过NF-κB信号途径诱导人星形胶质细胞表达IL-6和IL-8。.7、AS与神经元共培养促进神经元轴突生长和突触形成，HCMV感染AS可抑制其促进作用。HCMV感染AS后，对其共培养的神经元存活和凋亡的影响差异无显著性，但神经元的突起数量和长度均低于Mock感染AS组。HCMV感染星形胶质细胞抑制共培养神经元内突触素-1和突触后致密蛋白95的表达。