以转运蛋白BcatrB和MfsM2为靶点从诺沃霉素类似物中筛选灰霉菌多药耐药抑制剂研究

Referring to fungicide resistance development, Botrytis cinerea is classified as a high-risk pathogen. Due to repeated and massive fungicide sprayings to protect the crops, multidrug resistance (MDR) of B. cinerea has become a very common and urgently problem to be solved. MDR based on increased express of drug efflux transporters gene, BcatrB and MfsM2 appear to be the dominant drug transporters. In previous research, three active compounds novonestmycin A, B and C were isolated and identified from strain HBERC-20821 with antifungal activity. Further studies showed that compound C could significantly increase sensitivity of fungicide on MDR strain, all compounds can significantly inhibit the expression of the gene BcatrB. On the basis of the preliminary work, targeting membrane transporter BcatrB and MfsM2, the subject screen inhibitory with significant effect from novonestmycin analogues of gene expression, and further study synergism of active compound and fungicide; confirm the feasibility of this method by screened compounds inhibit multidrug resistance of B. cinerea. Through this research, it not only can obtain a new modulator of multiple drug resistance of B. cinerea, also provides a new method for the control of B. cinerea and new drug screening

灰霉菌是一种高抗性风险的农业致病菌。随着化学药剂大量长期使用，多药耐药已经成为该菌种一个非常普遍和迫切需要解决的问题。文献研究表明，灰霉菌多药耐药现象是由于转运蛋白高表达引起，BcatrB和mfsM2是其中关键转运蛋白基因。本课题在筛选农用抗生素时，得到一株良好抗真菌活性菌种HBERC-20821，并从中分离鉴定活性化合物诺沃霉素 A ，B和C，进一步实验显示化合物C可以明显增加杀菌剂对多药耐药灰霉菌敏感性，并且所有化合物均可以显著抑制基因BcatrB的表达。本课题在前期工作基础上，以膜转运蛋白BcatrB和mfsM2为靶点，筛选对基因表达具有有显著抑制作用的诺沃霉素类似物，并且进一步研究筛选得到化合物增效作用，验证筛选得到化合物抑制灰霉病多药耐药的作用和该筛选靶标可行性。通过本课题研究，不仅有可能得到一种新的灰霉病多药耐药抑制剂，也为灰霉病的防治和新药筛选提供一种新的思路和方法

本课题组从放线菌HBERC-20821中分离两个新大环内酯类化合物诺沃霉素 A 和B，体外活性测试表明化合物对部分植物病原真菌显示了很强的抗菌活性，通过盆栽实验试验表明该类化合物在活体植株上也具有良好的抗真菌活性，进一步的研究表明诺沃霉素类似物可能是通过抑制多药耐药转运蛋白表达而起到增效作用，本课题将大量分离制备诺沃霉素类似物，筛选对膜转运蛋白BcatrB和mfsM2基因表达同时有显著抑制作用的诺沃霉素类似物，并且进一步研究筛选得到化合物增效作用，为其生产应用打下理论基础。本项目的研究内容包括诺沃霉素大量发酵以及类似物分离、结构鉴定、活性评价，诺沃霉素稳定性和降解实验，诺沃霉素A对真菌病害防治效果和诺沃霉素防治水稻病害田间试验等。本研究分离纯化鉴定其他6个化合物结构，同分异构体之间活性没有显著差异，在菌种发酵液中，诺沃霉素A和B的含量最高，其他成分含量较低；通过温和酸水解，发现诺沃霉素B，首先水解去氧糖成为诺沃霉素A，接着一部分诺沃霉素A发生去羟基化和重排反应，生成一系列诺沃霉素类似物，一部分诺沃霉素A继续水解另一个去氧糖片段，生成苷元以及一系列苷元类似物。水解之后，化合物活性下降，这个结果表明去氧糖链对于杀菌活性比较重要，在今后的应用中，应该以固体制剂为主，防止有效成分水解；诺沃霉素A对灰葡萄孢具有良好的抑菌活性，对番茄果实灰霉病以及对西瓜立枯病也具有良好的防治效果，抑菌谱研究表明其对常见植物病原真菌核盘菌、胶孢炭疽和立枯丝核菌等具有良好抑制效果，但其对卵菌纲疫霉菌以及细菌劳尔氏菌无效。可以用于蔬菜和瓜果的生物防治；田间试验表明诺沃霉素对水稻纹枯病的防治效果在72.89—81.93%之间，增产率在8..30—9.93%之间，且大用量的诺沃霉素防治效果高于市售的24%井冈霉素防治效果。但对稻瘟病的的防效一般，防效均在33%以下。诺沃霉素可以作为防治水稻纹枯病效果好的生物农药在湖北大面积推广应用。