基于群体感应淬灭机制干扰铜绿假单胞菌致病性和耐药性的实验研究

随着细菌耐药性日益加剧，迫切需要发展新的药物来治疗细菌性感染，而抗病原菌毒力成为当前研究热点。群体淬灭是以病原菌群体感应系统信号分子为靶标，通过干扰和破坏病原菌的群体感应系统，可以有效的削弱病原菌的致病力。AiiA蛋白为革兰氏阴性菌群体感应信号分子AHL水解酶，本研究以aiiA为目的基因构建载体，并转化到铜绿假单胞菌野生型菌株和对不同抗生素耐药的临床分离株，分析转化前后铜绿假单胞菌aiiA表达、AHL含量以及对动物感染能力、毒力因子表达、生物被膜形成能力、耐药基因表达以及抗生素敏感性是有存在显著性变化，以说明AiiA对铜绿假单胞菌致病性、耐药性的影响，揭示铜绿假单胞菌受群体感应调控的致病性基因致病机制，为后抗生素时代如何防治革兰氏阴性细菌致病性提供临床试验依据，为耐药细菌生物防治提供可能。

随着细菌耐药性日益加剧，迫切需要发展新的药物来治疗细菌性感染，而抗病原菌毒力成为当前研究热点。群体淬灭是以病原菌群体感应系统信号分子为靶标，通过干扰和破坏病原菌的群体感应系统，可以有效的削弱病原菌的致病力。.本课题在国家自然基金（81071408）资助下以群体淬灭机制干扰铜绿假单胞菌致病性、生物膜形成和对抗生素的敏感性，揭示群体感应调控铜绿假单胞菌致病性、生物膜形成和抗生素敏感性变化的机制。AiiA蛋白是一种内酯酶（AHL-Lactonase，简称AiiA蛋白），具有降解群体感应信号分子AHL的特异性水解酶，本课题以aiiA为目的基因构建穿梭载体并转化铜绿假单胞菌，分析转化前后铜绿假单胞菌aiiA表达、毒力因子的变化、生物被膜形成能力的变化以及对常用抗生素抑菌圈直径的变化。.源于枯草芽孢杆菌的aiiA基因克隆至穿梭载体并转化至PAO1和临床分离铜绿假单胞菌, Western blot显示AiiA 蛋白在铜绿假单胞菌中正确表达。比较转化前后铜绿假单胞菌的变化，取得了如下结果：（1）AiiA表达的铜绿假单胞菌的生长没有受到影响。（2）aiiA 表达菌株毒力因子的含量明显少于野生型株和空载体转化对照株：①弹性蛋白酶活性降低；②绿脓素含量显著性降低，随时间增加没有明显变化；③外毒素A含量显著性降低；④鼠李糖含量显著性降低⑤aprA、toxA、LasB三种毒力因子mRNA转录水平明显受到抑制（3）AiiA表达的铜绿假单胞菌群游运动明显受到抑制。（4）AiiA表达的铜绿假单胞生物膜形成受到影响：生物膜结构明显受到抑制，而且膜内包被的细菌数量大大降低（5）表达aiiA基因的重组PAO1抗生素抑菌圈直径扩大，而且表达aiiA基因的重组铜绿假单胞菌（临床株）对抗生素的耐药性明显降低。.aiiA基因转化至铜绿假单胞菌后，降解了铜绿假单胞菌信号分子，并没有影响细菌的生长，但细菌的致病性显著性降低，而且铜绿假单胞菌生物膜的形成受到影响，对常用抗生素抑菌圈直径扩大。这也说明铜绿假单胞菌群体感应系统调控该菌的致病性、生物膜的形成和对抗生素的敏感性，这为铜绿假单胞菌感染治疗提供了新的实验依据。