肝内乙型肝炎病毒准种分布和cccDNA甲基化在核苷类似物停药复发中的作用研究

核苷类似物的停药问题是目前临床上慢性乙型肝炎治疗的热点和难点之一，本研究以接受核苷类似物治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者为研究对象，在获得完全应答后继续治疗24周停药，前瞻性地观察停药后的病毒学应答情况，研究停药时肝内HBV准种分布、肝内共价闭合环状DNA（cccDNA）水平和甲基化状态在停药复发中的作用。应用生物信息学技术分析停药复发者与持久应答者之间肝内HBV准种分布特征的差异，并比较停药复发者与持久应答者之间肝内cccDNA水平和甲基化状态的差异，分析外周血HBsAg水平与cccDNA水平和甲基化状态之间的相关性，研究在抗病毒压力下HBV的适应性进化，比较停药复发者和持久应答者之间进化模式的差异，从分子进化和cccDNA甲基化角度探讨核苷类似物停药复发的分子病毒学机制，并提出预测核苷类似物停药复发的新指标，为探讨核苷类似物的有限治疗策略提供理论依据和临床决策参考。

第一部分：研究经核苷类似物治疗后达到完全应答的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者在停药时肝内HBV准种分布特征和DNA甲基化与停药复发的关系。入选了18例接受核苷类似物治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，在达到停药标准后进行肝组织活检，前瞻性随访观察停药12个月内的病毒学应答情况，比较停药复发组和持久应答组肝内HBV准种分布和3个CpG岛甲基化状态差异。结果显示在一年的随访期内，8例患者出现停药复发，10例患者持久应答。停药复发者和持久应答者之间的基线的临床特征包括年龄、性别、基因型、病毒载量和抗病毒治疗时间没有统计学差异，两组间在停药时HBsAg定量水平也没有统计学差异。通过生物信息学分析发现，无论是逆转录酶（RT）基因区还是包膜蛋白(S)基因区,停药复发组肝内HBV准种复杂度和多样性均显著低于持久应答组（p<0.01）。通过前瞻性研究结果提示肝内HBV准种可作为核苷类似物停药复发的预测指标之一。停药时两组间肝内HBV 3个CpG岛甲基化状态无统计学差异（p>0.05）。结果提示肝内HBV准种可作为核苷类似物停药复发的预测指标之一，而HBV DNA甲基化和停药复发的关系还不明确，需要进一步研究。.第二部分：研究乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭前C/C基因准种特征。乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭的发病机制还不很明确，而准种与病毒持续感染和疾病发生有关。本研究应用生物信息学方法从病毒准种角度探讨肝衰竭的发病机制。入选11例慢加急性肝衰竭和10例慢性乙型肝炎患者，PCR扩增前C/C基因区，克隆后测序。应用生物信息学技术计算前C/C基因区的准种复杂度和多样性以及发生在前C/C基因上的正性选择位点，进行组间比较。结果显示慢加急性肝衰竭组前C/C基因区的准种复杂度和多样性均高于慢性乙型肝炎组(p<0.05), 慢加急性肝衰竭组前C/C基因区出现G1896A位点突变的频率明显高于慢性乙型肝炎组(P = 0.0005)。正性选择分析显示慢加急性肝衰竭组出现正性选择位点频率高于慢性乙型肝炎组，而且大部分出现在免疫表位区。本研究结果提示慢加急性肝衰竭组前C/C基因区表现出明显不同的准种结构特征，病毒通过增加自身的准种复杂度和多样性以及正性选择作用可能与慢加急性肝衰竭的发病有关。