乙型肝炎病毒cccDNA与病毒耐药发展和肝外感染关系的研究

1.分析HBV复制原始模板cccDNA在HBV耐药中的演变特点，阐明其对病毒耐药发展的影响；2.分析外周血单个核细胞(PBMC)cccDNA基因型耐药与表型特性，解析 PBMC在HBV肝外感染中的作用。方案如下：1.动态采集40-60例耐药患者血样，分离血清(浆)和PBMC，部分患者采集肝穿组织；2.测序比较同患者同时间采样中cccDNA与rcDNA、肝组织/血清(浆)cccDNA与PBMC cccDNA耐药变异差异；3.对差异明显的配对样本克隆测序(20个/样)；4.体外检测代表性样本的病毒复制、转录和表达水平；5.结合临床资料分析结果。研究已具基础，包括建立了大样本耐药患者跟踪系统并收集了部分患者血样和肝穿组织，创建了高度特异灵敏的PSAD消化+滚环扩增+跨缺口PCR检测 cccDNA技术等。结果将帮助阐明乙型肝炎防治中的重要科学问题：cccDNA与HBV耐药发展和肝外感染的关系。

本课题利用核苷（酸）类药物选择下产生的特定耐药变异作为分子标签，可以帮助排除HBV自然变异产生的病毒准种序列多样性的干扰，阐明HBV复制原始模板共价闭合环状DNA(cccD)NA对病毒耐药发展的影响及其PBMC在HBV肝外感染中的作用。.本课题取得的主要发现包括：1. 创建了基于滚环扩增的HBV cccDNA特异检测新方法，实现了对微量cccDNA进行定量和扩增测序。2. 首次发现核苷（酸）类药物耐药患者外周血单个核细胞（PBMC）中cccDNA主要为野生序列而非耐药突变序列，而血清HBV DNA中的耐药变异与肝细胞内的cccDNA耐药序列变异特点基本一致，证明耐药变异株可以cccDNA形式长期存于肝细胞核内，并提示PBMC是HBV cccDNA的肝外感染的对象。我们还证明PBMC来源的cccDNA复制子在转入HepG2细胞后，具有正常水平的病毒复制活性，提示PBMC是HBV的肝外贮存库。3. 首次系统明确了急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎各个分期患者肝组织HBV cccDNA水平与血清HBsAg和HBV DNA水平的相关。4. 发现并鉴定了新的阿德福韦原发耐药变异rtA181S、rtN236V；发现肝细胞癌患者HBV前S1缺失变异检测出率较慢性乙肝患者显著增高，且血清检测前S1缺失阳性患者的肝组织HBV cccDNA中也可检出前S1缺失突变株。 .以上研究共发表学术论文8篇（含SCI论文5篇）、综述和述评3篇，修回在审SCI论文1篇，其中1篇发表论文被我国《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）引用；在美国肝病年会上发言报告1篇，在亚太肝病年会上壁报交流1篇；获得国家发明专利授权2项；获得解放军总后勤部卫生部临床新技术应用批件1项；参与获得国家科学技术进步二等奖1项；培养博士研究生毕业1名、硕士研究生毕业2名，培养中青年学术带头人1名。总体上完成了课题任务书的研究指标。.课题研究中存在的问题主要包括：1. 由于目前耐药慢性乙型肝炎诊断明确，加上肝纤维化无创检查（如Fibroscan检查）的普及，很少有诊断明确的患者愿意接受肝穿检查，最终只获得了6例既有肝穿又有全血样本的病例。2. 对PBMC感染HBV的机制尚未完全明确，影响了高影响因子论文被录用发表的进度。