拟南芥去SUMO化修饰蛋白酶调控植物开花的分子机制研究

SOC1 is an important floral integrator, which activates transition to flowering under long days and short days. Previous reports have shown that SOC1 transcription level is regulated by CO, FT, FLC, SVP, AGL24, ELF9, SPL9 and SOC1 itself. Our previous report indicates that SUMO E3 ligase, AtSIZ1, negatively regulates SOC1 transcription level, suggesting that SUMOylation/deSUMOylation may play important roles in SOC1 transcriptional regulation, but the molecular mechanisms in which involves the known SOC1 transcriptional regulators remains to be determined. Recently, we found that the mutation in an Arabidopsis SUMO Protease 1 (ASP1) caused down-regulated SOC1 expression level and delayed flowering time under both long days and short days. The ASP1 mutation caused reduced transcription level of SPL9, a SOC1 transcriptional activator, but not CO, FT, FLC, SVP, AGL24 and ELF9. The research will determine if SUMOylation/deSUMOylation involves in the post-translational regulation of known SOC1 transcriptional regulators. The research will also analyze if the ASP1 regulates epigenetic marks on MIR156 genome region, since miR156 represses SPLs through an age dependent pathway. This project will provide comprehensive functional understanding of a SUMO protease, ASP1, in plants and provide insight into the role of sumoylation in plant developmental control and chromatin remodeling.

SOC1作为开花途径中的整合因子，在转录水平受到CO、FT、FLC、SVP、AGL24、ELF9、SPL9和SOC1蛋白的调控。另外，我们前期工作发现，SUMO E3 连接酶AtSIZ1负调控SOC1的基因表达。由此推测，SUMO化修饰和去SUMO化修饰过程在SOC1的转录水平调控过程中起重要作用。但是，SUMO化修饰调控SOC1基因表达的分子机制尚不清楚。最近我们发现，拟南芥中一个编码SUMO protease的基因ASP1突变导致植物在长日照和短日照条件下均晚花，并且asp1突变体中SOC1和 SPL9的表达量下降。基于此，本研究将探究ASP1通过SUMO化修饰调控SOC1调节因子的分子机制，并且检测ASP1是否调控MIR156的表观遗传学修饰而影响SPL9的表达。本项目通过对拟南芥SUMO protease ASP1的功能研究，将深入阐明SUMO化修饰调控染色质重塑和开花途径的机制。

SUMO化修饰是一类广泛存在于真核生物细胞内的类泛素化修饰。在模式植物拟南芥中，SUMO化作用在植物体生长发育及应对逆境胁迫过程中均扮演着重要的角色。SUMO蛋白酶在SUMO化作用过程中主要负责前体SUMO分子的成熟及底物蛋白的去SUMO化。经生物信息学预测，拟南芥中可能的SUMO蛋白酶超过60个，其中仅有4个（ESD4，ELS1，OTS1和OTS2）得到了证实。通过表型筛选，我们发现可能的SUMO蛋白酶ASP1基因缺失突变体在长日照及短日照条件下均表现出晚花的表型，其中长日照下与野生型的差异更大。用ASP1基因自身启动子加上基因组DNA可互补asp1突变体的晚花表型，说明该表型是由于ASP1基因缺失所引起的。通过体外的前体SUMO切割实验以及体内热激前后SUMO profile的变化比较实验，证实ASP1具有SUMO蛋白酶活性。用ASP1酶活缺失基因ASP1(C577S)无法互补asp1突变体的晚花表型，说明ASP1调控开花时间依赖于它的SUMO蛋白酶活性。已知SUMO E3连接酶SIZ1基因缺失突变体具有早花的表型，遗传学分析后发现SIZ1对于ASP1具有完全的上位效应。原生质体共转实验表明ASP1定位于细胞核。用带有GUS标签的互补材料做组织染色分析，表明ASP1主要在幼嫩组织中（包括根尖、茎尖，以及幼嫩的花芽和种子）具有高水平的表达。.为了分析ASP1调控植物开花时间的分子机制，首先我们检测了开花整合因子FT，FD以及SOC1的基因表达情况，结果表明以上三个基因的转录水平在asp1突变体中均有了明显的下调。随后我们分析了这些整合因子上游的重要调控因子的基因表达情况（包括CO，FLC，FLM 以及SVP），结果表明这些基因的转录水平都没有明显变化。而遗传学分析结果表明，asp1-1 flc-3双突变体的开花时间更靠近flc-3，说明二者具有很强的相关性。之前已有报道称FLC蛋白可在体外发生SUMO化修饰，而经反复试验我们未能在植物体内检测到FLC的SUMO化条带。而对FLC蛋白水平的分析发现，相比较于野生型，asp1突变体中含有更多的FLC蛋白。进一步的蛋白降解速率检测结果表明，asp1突变体中FLC蛋白更加稳定。综合以上结果，我们验证了SUMO蛋白酶ASP1的酶活性；ASP1通过SUMO蛋白酶活性影响FLC蛋白的稳定性从而正向调控植物的开花时间。