转录后选择性剪接相关基因C20ORF14在人胚胎干细胞自我更新维持中的功能和机制研究

Human embryonic stem cells (hESCs) possess capacities of indefinite self-renewal and differentiation into any cell types of an organism, holding great application potential. Understanding the molecular mechanisms controlling their unique properties is important for efficient amplification of hESCs. Previously, we identified a list of important genes required for hESC self-renewal. Among these genes, C20ORF14 is selected for this program. C20ORF14 is known to implicate in the regulation of posttranscriptional RNA alternative splicing events. However, its function in hESC has not been reported. Our preliminary results indicate that C20ORF14 possibly regulates gene expression via an alternative splicing mechanism to affect genome stability and self-renewal in hESC. In this program, we plan to further verify the relationship of C20ORF14 with hESC genome stability; identify key effectors mediating the function of C20ORF14 for the maintenance of genome stability; elucidate the underlying mechanisms by which C20ORF14 controls alternative splicing events. Through completing this program, we seek to understand the molecular basis of hESC genome stability maintenance and cell fate determination at an alternative splicing level and to provide guides for efficient amplification and directed differentiation of hESCs.

人胚胎干细胞（human embryonic stem cell, hESC）具有无限自我更新和分化为机体内任何种类细胞的能力，有广泛的应用前景。阐明其特性维持的分子机制对hESC的应用具有重要意义。我们在前期研究中发现了若干个对hESC自我更新所必需的重要基因，包括本项目拟研究的C20ORF14。已知该基因参与转录后RNA选择性剪接的调控。但它在hESC中的作用尚无报道。我们的初步研究结果显示，C20ORF14可能在转录后层面调控hESC的基因表达，进而影响hESC基因组稳定性和自我更新。我们拟在本项目中，确认C20ORF14与hESC基因组稳定性的关系；发现C20ORF14维持hESC基因组稳定性的关键效应分子；阐明C20ORF14调控选择性剪接的分子机制。通过本项目的实施，揭示RNA选择性剪接事件对基因组稳定性和细胞命运决定的调控机制，为提高hESC体外扩增和定向分化效率养提供指导。

人胚胎干细胞（human embryonic stem cell, hESC）具有无限自我更新和分化为人体内任何类型细胞的能力。hESC不仅可以作为研究胚胎早期发育的体外模型，还能为细胞治疗和药物发现提供充足的细胞资源。但是，hESC存在长期培养下基因组不稳定的现象，这严重地限制了hESC的应用。因此，阐明hESC基因组稳定性调控的分子机制十分重要。我们发现，基础剪接体组分C20ORF14对于hESC基因组稳定和自我更新状态的维持是必需的。在hESC中，C20ORF14敲低二天后细胞发生DNA损伤，表现为gH2A.X蛋白水平的上调、彗星实验尾巴增长和DNA损伤响应信号通路激活等。C20ORF14敲低三天后，hESC发生细胞凋亡，表现为TUNEL染色阳性细胞数目增加、剪切形式的Caspase-9和Caspase-3蛋白水平增加等。这些结果提示C20ORF14参与维持hESC基因组稳定性和存活。RNA-seq分析显示C20ORF14敲低后引起许多与基因组稳定性相关的基因发生异常的可变剪接，提示C20ORF14可能通过调控关键基因的可变剪接事件维持hESC基因组稳定性，进而保持hESC自我更新。进一步地，免疫共沉淀联合质谱实验显示，在hESC中C20ORF14与RNA m6A甲基转移酶复合体相互作用。同时，我们发现敲低RNA m6A甲基转移酶复合体的各主要组分或与可变剪接相关的RNA m6A识别蛋白YTHDC1也会引起hESC DNA损伤。利用新生RNA的m6A特异甲基化RNA免疫共沉淀测序（MeRIP-seq）实验，我们发现C20ORF14参与调控hESC新生RNA的m6A修饰，并且C20ORF14调控的m6A修饰参与了可变剪接过程。此外，一些基因组稳定性相关基因的可变剪接和m6A修饰同时受到C20ORF14的调控。综上所述，本研究显示，C20ORF14通过调控一些与基因组稳定性相关基因的RNA m6A修饰和可变剪接，维持hESC基因组稳定性。本研究在基因转录后调控的两个层面：RNA m6A修饰和可变剪接，揭示调控hESC自我更新和基因组稳定性的新机制。