RNA剪接蛋白PRPF8调控人胚胎干细胞自我更新和分化的作用及机制研究

Human embryonic stem cells (hESC), derived from the inner cell mass of the blastocysts of human embryos have two unique characteristics, unlimited self-renewal in vitro and pluripotency. Despite the extensive studies on the regulatory role of the core transcription factors and the signaling-pathway in hESC, post-transcriptional regulation of RNAs in hESC is largely unknown. Our preliminary data indicate that pre-mRNA processing splicing factor 8 (PRPF8) is essential for the self-renewal of hESC. It is possible that PRPF8 regulates the p53 signaling pathway through the post-transcriptional regulation of RNA splicing processing. In this project, we plan to further verify the function of PRPF8 in the maintenance of hESC self-renewal and regulation of differentiation; identify key downstream targets of PRPF8 and the manner by which it acts; find key genes involved in p53 signaling pathway regulated by PRPF8; elucidate the molecular mechanism by which PRPF8 regulates gene expression. Through completing this study, we hope to reveal a pathway important for hESC self-renewal controlled by PRPF8 for post-transcriptional regulation of p53 signaling pathway. This study will help to understand the underlying mechanism of the regulation network for hESC self-renewal and to guide directed differentiation of hESC.

人胚胎干细胞（hESC）是来源于人囊胚期内细胞团细胞，具有在体外无限自我更新的能力和分化的多能性。目前，关于hESC调控机制的研究主要集中在转录因子与细胞外信号通路。关于RNA转录后调控以及p53信号通路在调控hESC自我更新与分化的研究非常有限。申请人课题组前期研究发现RNA剪接复合体成员PRPF8对维持hESC自我更新具有重要作用，并有可能是通过调控p53信号通路的相关基因表达来行使其功能。本项目拟1）进一步确定PRPF8在hESC自我更新维持与分化调控中的作用；2) 发现PRPF8在hESC调控的关键靶基因及作用方式；3) 找到受PRPF8调控的p53相关基因；4) 揭示PRPF8调控基因表达的分子机制。通过本项目的实施希望揭示以PRPF8为主导，在转录后水平调节p53信号通路活性，对hESC自我更新维持的调控机制, 从而完善hESC自我更新的调控网络和为hESC定向分化提供指导。

人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells, hESCs）具有无限自我更新能力和分化成为所有种类成体细胞的潜能，在疾病模型的建立，药物筛选和再生医学方面具有非常广阔的应用前景。然而，当hESCs对各种应激或损伤做出反应时，往往会发生凋亡。了解hESC的分子调控机制与hESC存活相关的新因素是确保hESC高质量的基础。在本研究中，我们报道了PRPF8，一种RNA剪接体组成成分，是hESC存活所必需的。PRPF8敲低诱导p53蛋白积累并激活p53通路，导致hESCs凋亡。下调p53的表达水平可以纠正PRPF8敲低所引起的细胞死亡，这表明PRPF8敲低通过激活p53途径触发hESC凋亡。此外，PRPF8敲低导致p53总蛋白水平急剧升高，而p53 mRNA水平保持不变。我们证明p53在PRPF8敲低细胞中的积累是由于p53蛋白稳定性的增加。这些发现提示PRPF8敲低可能通过翻译后修饰导致p53蛋白的积聚，进而引起hESC细胞凋亡。.通过对RNA测序数据的深入挖掘，我们发现与对照组细胞相比，在hESC中敲低PRPF8时Pirh2可变剪接事件发生改变，出现了Pirh2B这一剪接变体。已有研究报道，Pirh2是p53的特异性E3泛素化连接酶。然而，由于部分RING结构域的缺失，Pirh2B缺乏泛素连接酶活性，其可能通过竞争性结合p53来拮抗全长形式Pirh2A的泛素连接酶活性，进而导致p53蛋白在细胞内的累积。为了验证PRPF8敲低是否通过该机制引起hESC凋亡，我们在PRPF8敲低细胞中同时下调Pirh2B的表达可以部分抑制PRPF8单独敲低导致的活细胞数目减少与p53下游基因的过度表达。.综上所述，在hESC中，PRPF8可能通过调控p53的E3泛素化连接酶Pirh2的可变剪接，维持hESC中p53的蛋白处于一个正常水平，保证细胞存活，进而维持hESC的自我更新。本研究不仅发现了一个具有维持hESC自我更新作用的新因子。而且，在分子机制上，揭示了PRPF8从转录后水平调控p53特异性E3泛素化连接酶Pirh2的mRNR前体可变剪接事件，实现在蛋白质翻译后水平维持hESC中p53的正常蛋白水平和hESC的存活。 因此，这一研究建立了hESC存活与mRNA转录后及蛋白质翻译后修饰之间的联系，为hESC的自我更新调控机制提供了新的线索。