葡萄糖代谢途径的转换在水牛胚胎干细胞维持自我更新中的作用及其应答机制研究

This project aims to solve the problems that buffalo embryonic stem cells can’t be stably passaged and lose their ability of self-renewal during culture. In order to explore the role and its response mechanism of glucose metabolic pathways switch in the maintenance of buffalo embryonic stem cells self-renewal mechanism, this project is undertaken to systematically investigate the role of oxidative phosphorylation and glycolysis in the maintenance of buffalo embryonic stem cell self-renewal ability by using cell energy metabolism detector, RNA-seq, ChIP-qPCR and RNA interference/overexpression techniques; focus on exploring the role and response mechanism of Wnt/β-catenin-HIF1α signaling pathway in the switch of glucose metabolism and maintaining self-renewal of buffalo embryonic stem cells. These research works will provide new insights for the improvement of buffalo and other large livestock embryonic stem cell culture conditions, and prospectively establish the true buffalo embryonic stem cell lines.

本项目针对水牛胚胎干细胞在培养过程中容易丧失自我更新能力，无法长期稳定传代的问题，以细胞葡萄糖代谢途径的转换与自我更新能力的关系为切入点，拟采用细胞能量代谢表型测定、RNA-seq、ChIP-qPCR和RNA干扰/过表达等技术手段，系统探讨氧化磷酸化和糖酵解这两条葡萄糖代谢途径在维持水牛胚胎干细胞自我更新能力的作用；重点探索Wnt/β-catenin-HIF1α信号通路在维持水牛胚胎干细胞自我更新中的作用及调控葡萄糖代谢途径转换的应答机制。本研究将为水牛和其他大家畜胚胎干细胞培养系统的改良提供新的理论依据，并有望获得能长期稳定传代的水牛胚胎干细胞系，为加速广西本地水牛品种的改良，加快我国南方水牛奶业的发展奠定基础。

胚胎干细胞在家畜扩繁和遗传改良领域具有巨大的应用潜能。它比体细胞更适合进行精确的基因打靶等遗传修饰，作为核移植供体的克隆效率是体细胞的10-20倍。因此，以胚胎干细胞介导的转基因克隆技术可以极大提高家畜的遗传改良效率。然而，由于缺乏长期稳定传代的家畜胚胎干细胞系，限制了该技术在家畜遗传改良中的应用。在本研究中，以水牛胚胎干细胞葡萄糖代谢途径的转换与自我更新能力的关系为切入点，探讨水牛胚胎干细胞维持自我更新能力的机制及其调控方法。首先，探明了葡萄糖代谢途径与水牛胚胎干细胞的自我更新能力的相关性：通过系统比较不同传代次数的水牛胚胎干细胞超微结构、多能性相关基因表达模式和葡萄糖代谢表型，发现水牛胚胎干细胞的糖酵解代谢与自我更新能力呈正相关。其次，构建并比较分析了不同传代次数胚胎干细胞的表达谱，预测并验证了维持水牛自我更新能力的核心因子（Nanog和TBX3）。继而，探索并建立了调控细胞代谢途径、促进细胞增殖的方法：在激活Wnt/β-catenin信号通路的同时，联合使用PS48和维生素C调控细胞代谢途径向糖酵解方向转换，可以促进胚胎干细胞增殖并延长细胞的传代次数。最后，还解析了维生素C和PS48调控细胞生物学特性的分子机制。本研究阐明了糖酵解代谢与水牛胚胎干细胞维持自我更新的关系并建立了调控方法，为水牛和其他大家畜胚胎干细胞培养系统的改良提供了新的理论依据，具有重要参考价值。