circ0008157海绵吸附miR-197-5p和miR-335-3p抑制黑色素瘤血管生成的研究

In our previous circRNA chip experiment on screening circular RNAs, we found circ0008157 was reduced expression in melanoma cells. Preliminary study showed circ0008157 inhibited progress of melanoma cells via silencing VEGF-A,the most important factor in angiogenesis. According to bioinformatics software, circ0008157 is predicted to be a target of miR-197-5p and miR-335-3p. And CYP4Z1 is the target gene of these two microRNAs. In this study, we aim at proving the angiogenesis phenotype suppressed by circ0008157 through sponging miR-197-5p and miR-335-3p in melanoma. We will explore the relationgship among circ0008157, miR-197-5p, miR-335-3p, CYP4Z1 and angiogenesis level of melanoma cells in vitro. Finally, we will discuss the value of circ0008157、miR-197-5p and miR-335-3p and angiogenesis related factors in melanoma patients by analyzing the collected clinical samples.

前期circRNA芯片发现circ0008157在黑色素瘤细胞中低表达，预实验发现circ0008157通过负向调控VEGF-A抑制黑色素瘤发生发展，而VEGF-A是促血管生成的关键因子。生物信息学分析及预实验microRNA芯片结果提示miR-197-5p及miR-335-3p与circ0008157均存在结合位点，且共同靶向CYP4Z1。本课题将以circ0008157调控miR-197-5p、miR-335-3p抑制黑色素瘤血管生成为主轴，从分子、细胞和动物实验三个层次探讨circ0008157海绵吸附miR-197-5p、miR-335-3p导致CYP4Z1蓄积抑制血管生成的机制；最后回归临床，探讨黑色素瘤中circ0008157、miR-197-5p、miR-335-3p及血管生成相关分子的表达量的临床意义。

前期circRNA microarray分析筛出circ0008157 与皮肤黑素瘤进展有关，并在黑素瘤组织及高侵袭力黑色素瘤细胞中低表达。预实验发现circ0008157 可抑制WM35及WM451细胞系的迁移侵袭。本课题首先通过FISH技术及核质分离实验，验证此circ0008157 在皮肤黑素瘤细胞系中的定位，预测可能调控机制；在此基础上，一方面通过生物信息学筛查并验证circ0008157 可能靶向结合的蛋白，另一方面利用RIP、RNA-pull down、FISH等方法，探索circ0008157与SENP3的互作关系，circ0008157对SENP3/HIF-1α 复合物稳定性的影响，以及circ0008157通过与SENP3相互作用，调节HIF-1α 的SUMO化影响其稳定性；再通过基因功能恢复实验，确定circ0008157通过调控核内蛋白功能参与黑素瘤进展的具体机制；利用circ0008157 上调及circ0008157及HIF-1α 均上调的WM35细胞系，分别构建异种移植瘤模型，从动物水平验证此circ0008157参与皮肤黑素瘤进展，以及上调HIF-1α 对逆转circ0008157对肿瘤增长的抑制作用；最后回到临床，探索circ0008157、靶基因、信号通路关键靶分子在组织及血液标本中的表达情况，筛选出黑素瘤可能的治疗靶点及早期诊断和预后监测的指标。