miR-33和miR-199a在黑色素瘤转移中的作用及机制探讨

在前期皮肤黑色素瘤临床研究中发现miR-33和miR-199a与黑色素瘤的高转移显著正相关的基础上，本课题以miR-33和miR-199a基因过表达或表达抑制的B16F10细胞株和裸鼠种植瘤及肺转移瘤为模型，在细胞和动物水平验证miR-33和miR-199a对黑色素瘤转移和血管生成生物学特性的影响，然后以基因芯片技术探讨miR-33和miR-199a对肿瘤转移基因表达的调控，筛选出受miR-33和miR-199a调控的下游转移基因；并运用生物信息学和荧光素酶报告基因技术从转录水平探讨miR-33和miR-199a对转移基因表达的调控机制；最后在临床标本和B16F10细胞株中验证miR-33和miR-199a作用的下游基因对黑色素瘤转移的调控作用，为临床诊断和治疗提供理论指导，形成转化医学的研究模式。

1、设计了let-7b,miR-33和miR-199a的过表达质粒和inhibitor干扰片段，运用基因转染技术将对应组别的外源基因导入B16F10或A375细胞中，成功完成基因转染，并通过Real-time PCR、Western-blot、MTT法及流式细胞术分别从RNA水平、蛋白水平和细胞水平三方面检测let-7b，miR-33和miR-199a基因对黑色素瘤生长与增殖及凋亡的影响，证实了let-7b，miR-33和miR-199a的表达与黑色素瘤生长与侵袭存在显著相关性，负调控黑色素瘤细胞的生长和侵袭，为黑色素瘤的关键miRNA；. 2、进一步采用美国SABiosciences公司的鼠源肿瘤转移PCR芯片( PAMM-028A )，在已知的84个转移相关基因中筛选了受let-7b和miR-199a调控的相关基因，其中发现受到let-7b正向调控的基因包括有Kiss1、Apc、Cdh6、Ctnna1、Cd44、Hgf、Cdh1、Hras1；可能受到负向调控的基因包括有：Flt4、Kiss1r、Hpse、Igf1、Il1b等。在 miR-199a调控的黑色素瘤转移相关基因中，可能正向调控的基因有：Cd44、Cdh1、Ctbp1、Etv4、Fxyd5、Rpsa、Mycl1、Myc、Nme2、Cd82、Rb1、Tcf20、Hprt1、Actb1；可能负向调控黑色素瘤B16F10细胞生长、侵袭的基因有：Ctsk、Csf1、Ela2、P2ry5、Hras1、Ctsk、Itga7、Tnfsf10。验证发现Myc基因受miR-199a负调控,Tnfsf10基因受miR-199a正调控。.3、稳定转染过表达miR-33a的A375细胞株的构建及裸鼠肿瘤模型的建立。.4、黑色素瘤及黑色素痣临床标本的收集及检测。