低氧诱导因子1α与辅助激活因子调节下游靶基因的新机理研究

Hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) is an important nuclear transcription factor and regulates over 60 target genes dependent on coactivators. Illustration of mechanism of coactivators interacting with HIF-1α contributes to the clinical application of HIF-1α to cardiovascular diseases and tumour. It is clear that 90% target genes of HIF-1α are regulated by two coactivators p300/CBP and HDAC, but there are 10% ones regulated by coactivators which are still unknown. The vital domains of HIF-1α are reconstructed , reserving its biological activity and high expression regardless of oxygen concentration, which avoids impact on the outcome of hypoxia and enzyme inhibitors.It is the background of one- factor experiment. Results of gene chips indicate that expression of coactivators p300/CBP and HDAC related to HIF-1α is increasing dramatically, that of other genes which function as coactivators as well. Whether these genes are coactivators of HIF-1α is uncertain, and it needs further research.It must be of great importance in physiology and therapeutics when new mechanism of regulation of HIF-1α is clarified.

HIF-1α 是一重要的核转录因子，需要在辅助激活因子作用下，调控60 多种下游靶基因。阐明其辅助激活因子的调节机理，是将HIF-1α 用于心血管疾病及肿瘤治疗的先决条件。已明确与其有关的两种辅助激活因子p300/CBP 和HDAC 调节90%HIF-1α 靶基因，但仍有10%靶基因的辅助激活因子不明。我们对HIF-1α 的重要结构区进行了改造，既保留其生物活性，又不受氧浓度影响，从而达到高效表达之目的，避免了以往用低氧及酶抑制剂进行实验所难以排除的其自身对结果的影响，为单因素研究打下了基础。基因芯片等结果显示：与HIF-1α 有关的辅助激活因子p300/CBP和HDAC 表达明显增高；并首次观察到其他有辅助激活因子功效的基因也明显增高，它们是否尚未确定的HIF-1α 的辅助激活因子，有待研究。如能明确，则可阐明HIF-1α 新的调节机制，将在生理学和在治疗学上具有重要意义。

低氧诱导因子1α（HIF-1α）是一个重要的核转录因子，需要在辅助激活因子作用下，调控100 多种下游靶基因。阐明其辅助激活因子的调节机理，是将HIF-1α 用于心血管疾病及肿瘤治疗的先决条件。已明确与其有关的两种辅助激活因子p300/CBP 和HDAC 调节90%HIF-1α 靶基因，但仍有10%靶基因的辅助激活因子不明。因而认为至少有三种机制调节HIF-1α下游靶基因的转录，然而，尚未阐明第三种辅助激活因子为何物。我们对HIF-1α 的重要结构区进行了改造，既保留其生物活性，又不受氧浓度影响，从而达到高效表达之目的，避免了以往用低氧及酶抑制剂进行实验所难以排除的其自身对结果的影响。因此，我们构建了三突变型HIF-1α慢病毒载体（PLV_CMV-HIF1a-2A-EGFP-2A-Puro）。将三突变型HIF-1α重组慢病毒载体与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293T细胞，包装慢病毒。重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞EA.hy926，嘌呤霉素（1μg/ml）筛选高表达HIF-1α细胞株，荧光显微镜下观察到大量增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达，Western blot检测提示Lenti-HIF-1α 组细胞稳定表达HIF-1α蛋白，并其表达明显高于Lenti-negative组及MOCK组，成功获得稳定表达HIF-1α的人脐静脉内皮细胞株EA.hy926。稳定表达HIF-1α的EA.hy926分别转染11198、54585及27086基因siRNA，48h后，Western blot结果显示：与control siRNA 组相比，11198、54585及27086基因均被成功敲降。11198、54585及27086基因经siRNA敲降后，Western blot 验证HIF-1α表达均下降，HIF-1α诱导的CH1非依赖性/TSA非敏感性基因（PLOD2、BNIP3等）的表达均下降。这些研究结果初步表明11198、54585、27086有可能为HIF-1α辅助激活因子。单因素研究HIF-1α对辅助激活因子及其下游靶基因的调节机制，解释其生理学上的多种功能，为HIF1α临床治疗打下基础。