柽柳bZIP转录因子激活调控下游基因的研究

干旱、盐碱或外源ABA 处理均能诱导植物bZIP基因的表达，其产物（转录因子）结合在抗性基因启动子的ABRE(ABA-responsive element)上，以此激活下游抗旱、耐盐等诸多抗性相关基因。因此，bZIP转录因子的抗逆作用越来越被人重视。本研究利用从柽柳中克隆并获得功能验证的bZIP转录因子基因为对象，研究其调控的下游靶基因。首先，将bZIP基因转入杨树中，筛选出耐盐能力优良的转基因株系作为进一步研究对象。利用杨树全基因组芯片筛选bZIP基因所调控的下游靶基因。利用国际杨树基因组测序结果，分析这些基因的的启动子序列，找出共同的顺式作用原件，用电泳迁移率实验检测bZIP蛋白与以上鉴定的顺式作用原件序列的结合,采用酵母单杂交等方法进行进一步验证。同时，对bZIP所调控的下游靶基因的代谢途径进行分析。综合以上结果，从而在分子和生理水平揭示bZIP基因在植物中所调控的抗逆途。

bZIP转录因子通过识别C盒、G盒和A盒顺式作用元件参与植物非生物胁迫的应答，在植物的抗逆过程中起重要作用。本研究通过TAIL-PCR的方法得到ThbZIP转录因子的启动子序列1789 bp。通过PlantCARE及PLACE分析发现，含有ABRE、E-box、 MYB、 WRKY和Wbox等与信号传递途径相关的顺式作用元件以及和植物抗逆及光照应答相关的顺式作用元件。将ThbZIP与GFP相融合，构建融合表达载体，转入洋葱表皮进行亚细胞定位，结果表明ThbZIP蛋白定位在细胞核中。酵母双杂交结果显示，ThbZIP转录因子单体无转录自激活活性，通过酵母双杂交系统共鉴定了9种与ThbZIP转录因子互作的蛋白，包括cysteine protease 、chitinase 、GAPC2 等。通过酵母双杂交研究了ThbZIP自身以及与其他从柽柳中克隆的13条ThbZIP基因能否互作。结果表明，ThbZIP能够与自身互作形成同源二聚体，并能与其他的10条bZIP基因互作，形成异源二聚体。ThbZIP能够与C盒、G盒和A盒互作，并且其识别能力为C盒>G盒>A盒。酵母单杂交发现，1条ThABF及2条ThMYC基因能够特异性地识别ThbZIP启动子上的元件，并调控ThbZIP的表达。实时定量RT-PCR证明，ThABF、ThMYC及ThbZIP基因在不同胁迫下具有相似的表达模式，进一步证明了ThABF、ThMYC及ThbZIP基因属于同一表达调控网络。将ThbZIP转入拟南芥中，转基因拟南芥的抗逆能力明显提高，显示ThbZIP具有抗逆能力。用cDNA microarray比较了转基因与非转基因拟南芥在正常，盐胁迫及ABA胁迫条件下的基因表达差异，在非胁迫下，共鉴定了差异表达基因564条（P<0.05；Fold Change>2）。其中，上调表达基因241条，下调表达323条。盐胁迫下，共获得差异表达基因2434条（P<0.05；Fold Change>2）。其中，上调表达1218条，下调表达1216条。ABA胁迫下，共获得差异表达基因3271条。其中，上调表达1662条，下调表达1609条。对芯片分析表明，ThbZIP基因能够调控一系列下游靶基因的表达，尤其是热激蛋白和一些转录因子，如锌指蛋白、WRKY、bHLH、bZIP、AP2、MYB和信号蛋白。