调节低氧诱导因子1转录活性的铜结合蛋白的探索

The master regulator of oxygen homeostasis, hypoxia-inducible transcription factor-1 (HIF-1), is a heterodimer composed of HIF-1α and HIF1β, and controls a diversity of cellular events. Under hypoxic condition, HIF-1 specifically upregulates the expression of a group of genes (including VEGF) involved in angiogenesis. This specificity of HIF-1 regulation of gene expression requires copper, which promotes HIF-1 transcriptional complex formation and its interaction with hypoxia-response element (HRE). What proteins mediate the effect of copper on HIF-1 activity? To answer this question, co-immunoprecipitation assay and IMAC followed by Label free LC-MS/MS and bioinformatics’ analysis were applied to HUVEC underwent CoCl2 with or without TEPA treatment. 2 copper binding protein candidates, NCOA5 and EWS, were found. The present study is intended to investigate the role of these two proteins in the copper regulation of specificity of HIF-1 activity by using HUVEC and mouse model of cardiac infarction. The copper-dependent and –independent HIF-1 regulation of angiogenesis will provide a fundamental understanding of ischemic disease, and of experimental and clinical approaches for intervention.

HIF1是机体应对低氧状况的核心转录因子，直接调控一百多个基因的转录，功能涉及血管新生、能量代谢、细胞增殖和细胞凋亡等多方面。低氧时，调控HIF1转录特异性的内源性机制尚不清楚。康裕建教授团队前期研究发现铜是HIF1转录特异性的调控机制之一。铜通过调控HIF1与下游基因的低氧反应元件结合，特异性调控HIF1下游诱导血管新生的VEGF等基因表达。细胞内没有游离的铜，那么起作用的铜结合蛋白是什么？我们前期实验用质谱结合生物信息学分析找个两个蛋白：NCOA5和EWS。我们假设这两个蛋白介导了铜对HIF1活性的调节。本项目将以人脐静脉内皮细胞和小鼠心梗模型为研究对象，用基因沉默、过表达、ChIP等方法探索NCOA5和EWS与HIF1转录活性调控的关系；用ChIP-Sequencing研究这两个蛋白调控HIF1转录特异性的机制；最后利用心梗动物模型验证这两个蛋白调节HIF1活性和修复心肌梗死的作用。

低氧诱导因子-1（HIF-1）是机体应对低氧状况的核心转录因子，直接调控着100多个基因的转录，功能涉及血管新生、能量代谢、细胞增殖和细胞凋亡等多方面。低氧时，调控HIF-1转录特异性的内源性机制尚不清楚。康裕建教授团队前期研究发现微量元素铜是HIF-1转录特异性的调控机制之一。细胞内没有游离的铜离子，那么起作用的铜结合蛋白是什么？我们前期实验用CoIP和IMAC结合质谱分析得到9个可能的铜结合蛋白，再根据软件预测和生物信息学分析找个两个蛋白：NCOA5和EWS。本项目在前期研究基础上，重点研究并阐明了铜调控HIF-1转录选择性的机制，发现铜通过调控HIF-1与下游基因的低氧反应元件（HRE）结合，特异性的调控部分HIF-1下游基因的表达。根据铜是否参与调控，将HIF-1下游基因分为铜依赖基因和铜非依赖基因。同时，采用ChIP-Sequencing和RNA-Sequencing结合的方法，在全基因组水平上探讨了铜调控HIF-1转录活性的情况。此外，本项目就NCOA5的研究发现，NCOA5与HIF-1蛋白结合，并且在心梗后不同时期表达和定位发生改变，非常有可能参与了铜对HIF-1转录活性的调控。