仙茅多糖及其活性片段对巨噬细胞的免疫调控机制及构效关系研究

Macrophages play an important role in the natural immune defense and adaptive immune response. Macrophages are the primary target cells many polysaccharides . Polysaccharides usually bind with receptors on the surface of the macrophages through specific segments of oligosaccharides, and then activate intracellular signal transduction pathways to start function and produce effects. The function principle and biological signal transduction mechanism of polysaccharides could be clarified through the studies on their receptors. Which could also provide a theoretical basis for the polysaccharide drug design, choice of targets and the determination of the regimen. The preliminary study on his project showed that curculigo polysaccharide had the function of macrophage activation. Curculigo polysaccharide can be further research because its primary, senior structure，structure-activity relationship and mechanism of macrophage activation are still not clear. This project aims to study the enzymatic degradation of the pure active curculigo polysaccharide, then the screening macrophage activity of the hydrolysate. The relationships between the activities and the primary, senior structures will be studied. The specific active oligosaccharide fragments of curculigo polysaccharide which binded with macrophage receptor and their mechanism of macrophage activation will also be systematically explored. The implementation of the project might provide significant theoretical basis for the polysaccharides drug development and their structure-activity relationship studies.

巨噬细胞在天然免疫防御和获得性免疫应答中起着重要作用。巨噬细胞是许多多糖的主要作用靶细胞，多糖通过其特异性寡糖片段与巨噬细胞表面的受体结合后，活化启动细胞内信号转导途径从而产生效应功能。对于受体的研究可以阐明多糖类药物的作用原理和生物信号转导机制，为多糖类药物设计、靶点的选择和用药方案的确定提供理论依据。申请人项目组前期研究发现，仙茅多糖对巨噬细胞激活作用确切。但目前仙茅多糖一级结构研究不深入，高级结构未见涉及，构效关系及对巨噬细胞激活作用机制不明确，具有进一步深入研究价值。本项目旨在对仙茅活性多糖纯级分进行酶法降解，酶解片段进行巨噬细胞活性筛选。探讨仙茅多糖纯级分及其酶解片段一级结构、高级结构与活性的关系;探寻仙茅多糖中与巨噬细胞受体结合的特异性活性寡糖片段，并较为系统地探讨活性片段激活巨噬细胞的作用机制。本项目的顺利实施将为多糖类药物的开发及构效关系的研究奠定较好的理论基础。

巨噬细胞在天然免疫防御和获得性免疫应答中起着重要作用。巨噬细胞是许多多糖的主要作用靶细胞，多糖通过其特异性寡糖片段与巨噬细胞表面的受体结合后，活化启动细胞内信号转导途径从而产生效应功能。对于受体的研究可以阐明多糖类药物的作用原理和生物信号转导机制，为多糖类药物设计、靶点的选择和用药方案的确定提供理论依据。本项目以仙茅多糖为研究对象，对其进行分离纯化，活性多糖纯级分筛选，运用葡聚糖酶和半乳聚糖酶对纯级分酶法降解，酶解片段激活巨噬细胞活性筛选，初步分析了多糖及其酶解片段分子量、单糖组成、糖苷键连接位置、空间结构。以小鼠巨噬细胞株 RAW264.7作为受试对象，从巨噬细胞吞噬、活化和提呈抗原的角度探讨 COP对巨噬细胞的激活作用并较为系统地探讨多糖及其活性片段激活巨噬细胞的作用机制。COP的主链核心区由这三种甘露糖、葡萄糖、半乳糖这三种糖残基构成；其主链边缘区域和支链主要由甘露糖、葡萄糖组成，支链或主链的末端残基主要由甘露糖、葡萄糖组成。推测XMP-1大致的糖链结构是：以1→3连接的甘露糖、1→2,6位连接的甘露糖、1→3,6位连接的甘露糖、1→4连接的甘露糖、1→4连接的葡萄糖、1→6位连接的半乳糖为主链；以1→位连接的葡萄糖为主链末端残基；以1→2,6位和1→3,6位甘露糖为糖链支点；含少数以1→3连接和1→4连接的甘露糖、1→4连接的葡萄糖为主要连接方式的支链。多糖分子链呈现出多分枝的结构，主要呈链状。XMP-1在水溶液中不是以螺旋结构存在，为自然卷曲结构。COP能不同程度地刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α、NO、IL-1β，并有明显的剂量-反应关系和时间-效应关系。COP各浓度组RAW264.7细胞的TNF-α、iNOS mRNA表达量显著升高，且具有剂量依赖性，COP可促进RAW264.7细胞TNF-α mRNA和iNOS mRNA的转录，从而诱导细胞分泌TNF-α和NO，发挥免疫调节活性；在内参actin保持均衡的情况下，COP对RAW264.7细胞表面TLR4、TLR2、MR、Dectin-1这四种受体蛋白的表达可造成不同程度的影响。其中，TLR2和TLR4受体在细胞受到COP刺激后变化不大；而MR和Dectin-1两类受体的表达较空白对照组有较大的提升，当COP浓度为250μg/mL时，MR和Dectin-1的表达量接近于LPS组。