甲状腺毒性周期性麻痹KCNJ18基因突变的分子致病机制研究

Thyrotoxic hypokalemic periodic paralysis (TPP) is characterized by acute attacks of weakness, hypokalemia, and thyrotoxicosis of various etiologies. TPP is the most common form of periodic paralysis, being most prevalent in young Asian men. The pathogenesis of TPP remains mysterious. While sequencing candidate genes, an unreported gene KCNJ18 gene that encodes an inwardly rectifying potassium (Kir) channel Kir2.6 was identified in a recent study. The study reported that mutations in KCNJ18 gene occur in some TPP patients. Kir2.6 mutations were present in up to 33% of the unrelated TPP patients in caucasian populations. This study will collect clinical data, blood from patients with thyrotoxic hypokalemic periodic paralysis. Mutational analysis of KCNJ18 gene in our TPP patients will be performed. The purpose of this study was to assess whether mutations in the KCNJ18 gene cause TPP in Chinese populations. We also want to elucidate the molecular mechanism of the causative protein and to determine how it relates to other proteins during the disease development. The study will contribute to further expand the knowledge on the molecular basis of TPP.

甲状腺毒性周期性麻痹(TPP)是一种以反复发作的肢体无力和瘫痪为临床特征，伴随低钾血症和甲状腺功能亢进症的骨骼肌疾病。该病多发生于亚洲国家的青年男性，既往认为该病是由于遗传与环境因素共同作用而发病，但致病基因和发病机制一直并不明确。最新的研究发现编码内向整流钾通道Kir2.6的KCNJ18基因突变与该病有关。在高加索人群中，TPP患者KCNJ18基因突变的比例占到了1/3，提示该基因可能为TPP发病的重要致病基因。本研究将在前期基础上，收集中国汉族人群的TPP患者，进一步明确中国TPP患者KCNJ18基因的突变谱。同时利用构建的细胞模型及原代培养的患者的成纤维细胞，采用膜片钳等相关的实验技术，研究KCNJ18基因突变对细胞离子通道功能和细胞静息电位的影响。通过以上研究，明确KCNJ18基因突变是否也为中国TPP患者重要的致病基因，并初步探索KCNJ18基因突变导致TPP发病的分子致病机制。

骨骼肌离子通道基因突变可引起一组较为罕见的可遗传性离子通道病。其中，伴有血钾水平降低的为低钾性周期性麻痹（HypoKPP）。HypoKPP根据病因可分为家族性低钾型周期性麻痹（FPP）、甲状腺毒性周期性麻痹（TPP）和散发性低钾型周期性麻痹（SPP）。TPP和SPP在临床表现中与FPP极为相似。2010年Ryan等首次发现KCNJ18新基因与TPP相关，该基因编码肌纤维上的内向整流钾通道Kir2.6，在维持钾离子平衡电位和调节细胞兴奋性等方面发挥重要作用。本研究共收集116例TPP和SPP患者，对所有患者的KCNJ18基因进行序列分析。在基因序列分析结果中，发现一例SPP患者携带一个新杂合点突变c.505G＞C，从而导致氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸（p.G169R）。对该患者进一步行肌电图长时运动诱发试验检测，研究结果表明该患者为周期性麻痹。目前在中国TPP患者中报道过4例KCNJ18基因相关突变，p.Q126X，p.K360T, p.E388K及p.A200P，其中，A200P突变型Kir2.6通道已验证为不具备内向整流钾通道功能，而p.Q126X, p.K360T与p.E388K则为首次报道的新突变，这些突变型通道电生理特性的改变尚需进一步的研究探索。本课题在体外实验中进一步验证了上述4种Kir2.6突变通道的电生理功能缺陷。本研究在体外构建pEGFP-Kir2.6野生型质粒，并在此基础上诱导为pEGFP-Q126X、pEGFP-G169R、pEGFP-K360T及pEGFP-E388K突变型质粒。通过转染至COS-7细胞中以检测通道蛋白的表达分布，随后运用膜片钳技术检测Kir2.6突变通道介导的钾离子全细胞电流变化。基于膜片钳技术，对本研究新发现的SPP相关突变通道（p.G169R），以及以往报道的3类中国人群中TPP相关突变通道（p.Q126X、p.K360T和p.E388K）的电生理特性进行的全细胞电流研究结果表明，上述4个突变型Kir2.6通道介导的钾离子电导性降低甚至于丢失，此外，突变通道亚单位对野生型通道亚单位具有明显的负性效应。另外，本课题还基于miRNAs芯片技术，对SPP患者组与正常对照组的肌肉标本进行了miRNAs芯片分析研究，miRNAs研究结果提示，miRNAs可能参与SPP的相关致病过程。