类泛素蛋白TgUrm1对弓形虫入侵和增殖的影响及其作用机制

Urm1 (Ubiquitin-related modifier-1) is one of the most primitive ubiquitin-like proteins of eucaryon. Functions are related to the cell growth, sulfur transport, nitrogen synthesis and antioxidant stress. At present, there is no research about Urm1 in apicomplexan parasites. Toxoplasma gondii is a model pathogen of zoonosis, and to analyze the functions and mechanisms of Urm1 in T. gondii is necessary. Our previous studies have showed that Urm1 ubiquitin-like system may exist in Toxoplasma, and the function is unknown. To explore the key role of TgUrm1 in parasites, a program was designed to observe the expression and location of TgUrm1, and analyze the effects of TgUrm1 on parasite invasion, proliferation and pathogenicity; Screening the TgUrm1 activating enzyme TgUba4 , and verifying the modification relationship between TgUrm1 and TgUba4, are necessary works to elucidate the molecular basis of TgUrm1's functions in T. gondii. Regulate the expression of TgUba4 in parasites to further verify the key role of TgUba4 on TgUrm1 functions. Finally, we expect to show the functions and mechanisms of TgUrm1 in T. gondii , and provide references for the research of other apicomplexan parasites.

Urm1（Ubiquitin-related modifier-1）是真核生物最古老的类泛素蛋白之一，与细胞的生长发育、硫转运、氮素合成及抗氧化应激等过程密切相关。目前，顶复门原虫中未见相关研究。弓形虫是重要的人兽共患病模式病原，明确Urm1在弓形虫中的作用及其机制是必要的。我们前期的研究发现弓形虫可能存在Urm1类泛素调控系统，但功能未知。为了探究TgUrm1在弓形虫生命活动中的关键作用，本申请项目拟鉴定弓形虫的Urm1类泛素调控系统，并明确TgUrm1对弓形虫入侵、增殖及致病的影响；筛选TgUrm1的泛素激活酶TgUba4，验证TgUrm1与TgUba4的互作修饰关系，初步阐明TgUrm1在弓形虫中发挥功能的分子基础；调控TgUba4的表达，明确TgUba4修饰作用对TgUrm1功能的影响。最终，初步揭示类泛素蛋白TgUrm1在弓形虫中的作用及其机制，为其他顶复门原虫的研究提供参考。

Urm1（Ubiquitin-related modifier-1）是真核生物最古老的一种类泛素蛋白，通过结合不同底物蛋白，参与细胞的生长发育、硫转运、氮素合成及抗氧化应激等过程。作为真核生物的弓形虫，未有Urm1的相关研究报道，明确Urm1在弓形虫中的作用及其机制是必要的。.项目负责人团队首次在弓形虫中鉴定了Urm1类泛素分子，发现弓形虫缺失该基因后生长缓慢，其入侵细胞、胞内增殖及运动能力均显著下降。此外，ΔUrm1虫株还表现出对小鼠致病力降低，不易形成包囊。综上表明，TgUrm1参与并影响了弓形虫的生长发育过程。.类泛素蛋白通过与底物蛋白结合，进而调控了生命体的多项生理机能。我们发现氧化剂刺激条件下TgUrm1会与多个底物蛋白结合，且TgUrm1的C-末端的GG基序是其结合底物蛋白的关键位点。利用蛋白质组学和生物素临近标记技术对TgUrm1的底物蛋白进行筛选，共鉴定到22个候选底物蛋白。以TgAhp1为例，经研究发现该蛋白具有过氧化氢酶活性，敲除Ahp1基因明显降低了弓形虫的抗氧化应激能力，免疫共沉淀显示TgAhp1和TgUrm1仅在氧化剂刺激条件下可以发生互作，且缺失TgUrm1的弓形虫对氧化应激耐受性降低。上述结果表明TgUrm1通过与底物蛋白TgAhp1结合，在弓形虫抗氧化应激过程中发挥重要作用。.类泛素需要被修饰后才能结合底物蛋白。通过蛋白质组学分析我们发现了TgUrm1的特异性类泛素修饰酶TgUba1 (Ubiquitin-like protein activator-1)。敲除TgUba1的弓形虫不再发生Urm1的类泛素化过程，表明TgUba1是TgUrm1唯一修饰酶。此外，TgUba1具备了两个用于类泛素修饰的保守结构域：E1-Like (AD)和Rhodanese (RHD)。与其他真核生物不同，经证实TgUba1仅依赖E1结构域即可完成TgUrm1的类泛素化修饰。.综上所述，本项目初步揭示了类泛素蛋白TgUrm1在弓形虫中的作用及其机制，为弓形虫代谢调控的研究提供新思路。在此基础上发现了数个防控弓形虫的新靶点，为有效抑制该病的传播奠定了基础。