藏药“甲嘎松汤”调节Nrf2/Bach1-ARE-抗氧化酶通路以抗氧化保肝的研究

Oxidative stress is the important pathologic feature of Liver injury diseases , but the effective clinical drug is in lacking. The Nrf2 / Bach1-ARE-antioxidase signal pathway is recognized as the key endogenous antioxidant stress pathways, so it is an effective means of preventing and curing the injured liver to balance Nrf2 and Bach1.The previous researches show that Traditional Tibetan medicine JiaGaSong Tang can protect the injured liver by antioxidation , which relates to Nrf2 and Bch1 ,but the mechanism is not clear. So we put forward a scientific hypothesis that JiaGaSong Tang may antagonise oxidative stress to protect liver in regulating the balance of Nrf2 and Bach1 to control the moderate expression of antioxidant enzyme gene. In this project, by using immune fluorescence, Western blot, RT-PCR and other methods ,we study the effect of RNA interfere Nrf2 or Bach1 on the hepatoprotective effect of JiaGaSong Tang. To clarify the protective mechanism of JiaGaSong Tang, in rat models and cell models ,we study the regulation effect of JiaGaSong Tang on the time regularity of Nrf2 and Bach1 , which including the expression in the nuclei and cytoplasm , nuclear shifting, and regulation antioxidant enzymes. This study will provide the experimental basis for choosing clinical indications and screening drugs of antioxidant hepatoprotective.

氧化应激是肝损害性疾病的重要病理特征，但临床缺乏有效的抗氧化药物。Nrf2/Bach1-ARE-抗氧化酶通路被公认是关键的内源性抗氧化应激通路，调控Nrf2和Bach1的平衡是防治肝损伤性疾病的有效手段。前期研究显示藏方"甲嘎松汤"通过抗氧化而保肝，其作用与Nrf2、Bch1有关，但其机制还不清楚。我们提出"甲嘎松汤" 可能通过调控Nrf2/Bach1的平衡而控制抗氧化酶基因的适度表达发挥抗氧化保肝作用的科学假说。本课题在保证制剂成分稳定的前提下，拟采用免疫荧光、Western blot、RT-PCR等方法，研究RNA干扰Nrf2和/或Bach1表达对"甲嘎松汤"保护肝细胞效应的影响；利用体外细胞和整体动物模型，动态地研究甲嘎松汤调控Nrf2和Bach1在胞核和胞浆中表达、移位、调节抗氧化酶的时间规律，以阐明"甲嘎松汤"保肝机制，为临床适应症选择提供实验依据，为抗氧化保肝药物筛选提供基础。

甲嘎松汤是一组藏药成方，由干姜、豆蔻、肉豆蔻组成（故又名三味干姜散），用于虚寒型肝炎，肝肿大，在藏医名著《四部医典》、《医学四续》与《蓝琉璃》中有记载，载入于《卫生部药品标准藏药分册》。本课题组从2011年开始对其药效作用进行了初步研究，表明甲嘎松汤对四种急性肝损伤动物以及慢性酒精性肝损伤动物均具有保护作用，但其作用机制尚不清楚。2012年获得资助，对该方的物质基础及其作用机制进行了研究。本课题组的主要研究内容及结果如下：.1.甲嘎松汤物质成分的研究：完成了药材的收集、鉴定、制剂制备，建立了HPLC和GC-MS指纹图谱；确定了总挥发油的特征性成分，并发现甲嘎松汤挥发油成分并不是单味药挥发油成分含量简单的相加所得，其物质发生了明显的变化。在一定程度上科学阐述复方配伍的科学性。课题组还通过体外实验确定单个抗氧化作用成分贡献的大小顺序。该部分研究保证了后续药效及作用机制研究中所用制剂的标准和稳定性。.2. 甲嘎松汤调控Nrf2/Bach1信号通路保护慢性肝损伤大鼠研究：通过制备慢性肝损伤大鼠模型，从Nrf2/Bach1信号通路的角度，考察了甲嘎松汤对肝损伤大鼠的保肝作用及对该通路Nrf2/Bach1核内外的影响；并在慢性肝损伤大鼠的不同病程探讨了甲嘎松汤对Nrf2/Bach1信号通路的调控作用与疾病严重程度的相关性。结果显示，甲嘎松汤能治疗慢性大鼠肝损伤，其保肝作用与在不同疗程中调控Nrf2、 Bach1因子有关。.3. 甲嘎松汤调控Nrf2/Bach1信号通路保护氧化损伤肝细胞及作用靶点研究。以细胞模型为研究对象，探讨甲嘎松汤对Nrf2/Bach1-ARE通路的调控作用，此部分研究包括两方面。第一部分内容：甲嘎松汤对氧化应激模型人肝细胞的作用。在分别用抑制剂抑制Bach1和激活Nrf2后,甲嘎松汤的含药血清保护作用增强,结果显示甲嘎松汤可能是通过双向调节Nrf2及促使Bach1移出细胞核,平衡二者在细胞核内的蛋白水平,进而调控抗氧化酶GSH-Px活力,来达到抗氧化保肝的作用。第二部分内容：甲嘎松汤对Nrf2或Bach1沉默氧化损伤肝细胞的保护作用。采用RNA干扰技术，沉默细胞Nrf2或Bach1，结果显示，甲嘎松汤具有较弱的直接增加Nrf2生成作用，其在“Nrf2/Bach1-ARE-抗氧化酶”通路的主要作用机制是下调Bach1反馈性地引起Nrf2的增多及入核。