藏药“嘎布得罗”抗肺纤维化药效物质及作用机制研究

Gebudilu is the manna for clearing epidemic heat from the lungs, according to the theory of Tibetan medicine. Scientific reports on its active components and mechanisms remain infrequence. Under the guidance of experts of Tibetan medicine, combined the recent advancement for mechanism research for idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), with our previous researches, we present the scientific hypothesis for this project as “The possible mechanism of Hetisine-type alkaloids, the potential active components of Gebudilu on IPF, would be by regulating oxidant stress and key targets of TGF-β signaling pathway. Therefore, the mechanism of alkaloids components from Gebudilu on drug transportation, regulation for metabolism of endogenous products, and interaction of NOX and TGF-β signaling pathway will be investigated and compared systematically between normal and pathologic status. The results are prospected to clarify the mechanisms for pharmacological and compatibility mechanisms of Gabudilu for IPF, and apply scientific reference for clarifying the nature of “the manna for clearing epidemic heat from the lungs”.

藏药嘎布得罗为“清肺疫热之甘露”，其药效物质及作用机制未见报道。在藏医临床专家指导下、结合肺纤维化药物作用机制新进展及前期基础，本项目提出“海替生型生物碱为嘎布得罗抗肺纤维化潜在的药效物质，其作用机制可能涉及调控氧化应激与TGF-β的交互作用干预肺纤维化信号通路的多个环节和靶点”的科学假说。项目拟通过活性组分的化学结构表征及其在机体不同状态下(正常和病理)药物转运(ADME)机制的解析，阐明其抗肺纤维化的药效物质；采用代谢组学，通过活性组分对生物标识物干预的量-效、时-效关系，明确嘎布得罗的药效规律；通过基于整体动物、组织细胞及分子水平的抗肺纤维化整体综合药效评价、对内源性小分子代谢的调控及其机制、对氧化应激及TGF-β通路关键节点的干预作用等三个方面，阐明嘎布得罗治疗肺纤维化的作用机制。为揭示嘎布得罗“清肺疫热之甘露”的现代科学内涵提供科学研究资料。

本项目首先采用LPS和TGF-β分别诱导的两种肺纤维化细胞模型，以细胞存活率以及羟脯氨酸HYP的表达情况为指标，进而筛选出具有较强抗肺纤维化活性的有效成分DTF-5（2α-羟基-11β-乙酰基-12β-异丁酰基海替生碱）。然后通过博来霉素（BLM）诱导大鼠形成肺纤维化实验动物模型，对藏药“嘎布得罗”中DTF-5进行抗肺纤维化的药效学研究，采用代谢组学方法，借助多元统计分析和生物学注释研究DTF-5干预BLM诱导的肺纤维化大鼠体内小分子代谢物的变化水平，结果发现DTF-5能够得到有效控制肺纤维化发展过程中的炎症及氧化应激过程，调节机体氧化失衡，以及氨基酸代谢紊乱，降低HYP水平及胶原蛋白合成，抑制肺部细胞向成纤维细胞的转化和肺实质化病变，从而延缓肺纤维化疾病的发展。.基于DTF-5的代谢组学数据建立代谢物-蛋白相互作用网络和分子对接研究，结果显示DTF-5配体与NOX4蛋白受体具有良好的对接活性，可能具有一定的交互作用，并在细胞水平上通过转染双荧光素酶报告基因的方式确定了NOX4是DTF-5重要的作用靶点，显示DTF-5对细胞氨基酸代谢紊乱、氧化损伤及纤维化进程具有关键的作用。随后采用WT小鼠和NOX4的KO小鼠在整体动物水平上深入探讨DTF-5介导NOX4靶点对TGF-β/Smads通路、α-SMA下游效应蛋白以及氨基酸代谢相关靶点的干预作用。结果证明了DTF-5通过抑制NOX4靶点及TGF-β/Smads通路的激活水平，并减少了由NOX4介导的ROS生成，缓解氧化失衡并恢复抗氧化能力,同时也抑制了下游胶原蛋白合成相关的氨基酸代谢酶CAT2、ARG1以及OAT的表达水平，减少了精氨酸、鸟氨酸、脯氨酸的转化活性，减缓了胶原蛋白的合成过程，降低胶原蛋白合成并延缓了肺纤维化的发展进程，揭示其“清肺热”的科学内涵，为藏药体内药效物质基础与作用靶标研究提供了具有一定借鉴意义的理论方法学体系。.本项目已完成了预期的考核指标，截至2022年12月31日，以通讯作者身份已发表SCI收录5篇；培养博士1名和硕士2名；项目执行期间申请并获授权国家发明专利1项。