多位点反基因锁核酸特异性抑制乙肝病毒保守区S/C基因复制与转录的机制研究

The hepatitis B virus(HBV) infection has become a danger to human health and up till now no specific medication has been found. The difficulty that how to inhibit the replication and transcription of HBV in cells remains unsolved although the antisense locked nucleic acid aimed at S mRNA of HBV has been studied in our previous research, and some progress has been made.Recently,we have discovered that anti-gene locked nucleic acid that were complementary to the purine-rich regions of HBV dsDNA can inhibit the replication and transcription of preS1 gene effectively in vitro. Therefore, based on the preliminary study, we should explore the inhibitory effects of anti-gene locked nucleic acid on replication and transcription of HBV targeting to the purine-rich regions of preS2, S, preC, and C in HBV, by using HepG2.2.15 cells and hepatitis B virus transgenic mice as materials, and by utilizing the biological techniques(such as RT-PCR, FQ-PCR, and TRFIA, etc.), in order to screen a potential target and multi-garget ant-gene locked nucleic acid fragment, illustrate the mechanism of DNA replication and transcription of HBV based on anti-gene locked nucleic acid. The results may provide theoretical and experimental basis for antiviral gene therapy.

乙肝病毒感染已成为危害人类健康的全球性问题，目前尚无特效药。虽然我们前期针对病毒S基因mRNA的反义锁核酸治疗研究取得了一些进展，但如何阻断细胞内病毒基因的复制与转录问题仍未解决。近来，我们发现互补于病毒S保守区前S1基因编码链第2941-2962 nt同聚嘌呤区的锁核酸对细胞内病毒前S1基因的复制与转录表现出较强的抑制作用。因此，本立项拟在前期研究工作基础上，进一步以HBV S、C保守区的前S2、S、前C和C基因的编码链同聚嘌呤区为靶点，利用RNA structure软件分别设计合成能特异性识别并结合到各靶点的锁核酸，分别以阳离子脂质体和半乳糖配体介导转染hepG2.2.15细胞株和HBV转基因小鼠，运用FQ-PCR、RT-PCR、TRFIA等技术，分析比较锁核酸对病毒各靶基因的复制与转录的抑制作用，以期阐明锁核酸抑制病毒基因复制与转录的机制，为抗病毒基因治疗提供理论和实验依据。

乙型肝炎是由乙肝病毒感染引起的一种传染性疾病，容易发展为肝硬化和肝细胞癌。目前，乙肝病毒对人类的危害已成为全球性健康问题，全球乙肝病毒携带者约有3.5亿，而我国约1.3亿。对于乙肝的治疗，目前临床仍缺乏特效药。该研究针对乙肝病毒S、C保守区DNA编码链富含聚嘌呤区，利用RNA structure软件分别设计合成能特异性识别并结合到各靶点的锁核酸片段，以阳离子脂质体介导转染HepG2.2.15细胞株，运用FQ-PCR、RT-PCR、TRFIA、DNA测序等技术，分析比较锁核酸片段对病毒各靶位基因的复制与转录的抑制作用，从中筛选出抑制作用较强的治疗靶点和锁核酸片段，并运用生物信息技术分析各锁核酸片段的序列特征，筛选出多位点锁核酸片段，再以HepG2.2.15细胞和HBV转基因小鼠为研究对象，进一步验证多位点反基因锁核酸片段对病毒基因复制与转录的抑制效果。细胞实验结果显示，加入LNA后6 d，对细胞HBV DNA复制均有较强抑制作用，单靶点S组、单靶点C组和双靶点SC组的平均抑制率分别为52.28%、53.14%和77.71%；HBsAg的平均抑制率分别为57.48%、52.14%和82.13%；HBeAg的平均抑制率分别为30.15%、29.78%和51.44%。动物实验结果显示，注射LNA后，对HBsAg表达均显示有较强的抑制作用，单靶点S组、单靶点C组和双靶点SC组的平均抑制率分别为38.8%、32.5%和57.3%；HBeAg的平均抑制率分别为35.7%、30.4%和55.8%；HBV DNA复制的平均抑制率分别为25.7%、23.6%和38.4%。注射后1、3、5 d，HBsAg的平均抑制率分别为15.7%、26.5%和32.9%；HBeAg的平均抑制率分别为14.8%、27.3%和31.8%；HBV DNA复制的平均抑制率分别为15.5%、21.4%和28.7%；小鼠肝细胞的HBsAg、HBcAg阳性细胞数均较对照组明显减少（P<0.05）；血清白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐等指标，各组结果与对照组比较，差异均无统计学意义。该研究初步阐明反基因锁核酸抑制乙肝病毒复制的分子机制，为抗乙肝病毒研究提供治疗靶点，为抗病毒核酸药物研究提供理论和实验依据。